尹太郎 丁錦麗 張怡 敖良飛 羅金 李潔 兗娜娜 楊菁

自1978年首例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術(shù)(assisted reproduction technology, ART)已在人類生殖領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注。而1995年囊胚培養(yǎng)技術(shù)的開始實(shí)施，更促進(jìn)了囊胚移植在ART中的發(fā)展與應(yīng)用。囊胚移植與卵裂期胚胎移植相比，具有以下優(yōu)勢：①胚胎與子宮內(nèi)膜同步化更好；②可選擇更有發(fā)育潛能的胚胎；③胚胎植入率及臨床妊娠率更高；④雙胎率更低[1-2]。但是，有研究證實(shí)，囊胚移植與周期取消率、性別偏移以及單卵雙胎(monozygotic twinning， MZT)發(fā)生率有關(guān)。目前結(jié)論尚不一致。MZT是指單個受精卵分化成兩個胚胎，其與早產(chǎn)、胎兒死亡以及宮內(nèi)發(fā)育遲緩等有關(guān)。研究表明，與MZT發(fā)生率相關(guān)的因素包括：受精方式、促排卵和輔助孵化等[3]。2009年發(fā)表的一項(xiàng)Meta分析表明，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植有更高的MZT率(OR：3.04，95%CI：1.54～6.01)[4]，但后期相關(guān)文獻(xiàn)卻又證實(shí)兩者的MZT率無顯著差異[5-6]。因此，我們擬通過Meta分析，綜合多數(shù)據(jù)分析，對比卵裂期和囊胚期鮮胚移植對MZT率的影響，為臨床提供進(jìn)一步的可靠證據(jù)。

對象與方法

一、檢索策略

以“囊胚”or“囊胚期”or “囊胚移植” and“卵裂期”and “鮮胚” or “新鮮周期” or“鮮胚移植”and“雙胎”or“單卵雙胎”and “輔助生殖”為檢索詞，在中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫及萬方醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫中查找中文相關(guān)文獻(xiàn)。以“blastocyst” or “blastocyst stage” or “blastocyst transfer” and “cleavage stage” and “fresh embryos” or “fresh cycle” or “fresh embryo transfer” and “twins” or “monozygotic twinning” and “assisted reproduction technology” 為檢索詞在PubMed、Embase、Web of Science和Cochrane library(via OVID)中檢索初始至2017年5月前發(fā)表的所有原創(chuàng)性研究論文。同時或單獨(dú)使用以上自由詞或主題詞。必要時手工檢索相關(guān)文章的參考文獻(xiàn)。

二、文獻(xiàn)篩選

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象為人類；②原創(chuàng)性研究；③鮮胚移植；④卵裂期胚胎包括Day2、Day3胚胎，囊胚包括Day5、Day6胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象為動物；②病例報道、畢業(yè)論文、系統(tǒng)綜述及Meta分析等；③凍胚移植；④供卵周期；⑤文獻(xiàn)為非英文或非中文。由2位研究者獨(dú)立對文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，對于有分歧的文獻(xiàn)則由第三方參與討論決定。初步篩選出260篇文獻(xiàn)，將其導(dǎo)入NoteExpress軟件后，剔除18篇重復(fù)文獻(xiàn)；閱讀摘要和全文，分析文獻(xiàn)的可利用性后，剔除224篇；最終納入18篇文獻(xiàn)。

三、資料提取

由2位研究者獨(dú)立提取信息，提取的內(nèi)容包括第一作者、發(fā)表年限、國家、研究時間、研究類型、患者/周期數(shù)、新生兒數(shù)、促排方案、受精方式、移植時期和培養(yǎng)基類型。并且，2位研究者交叉檢查對方提取的信息，有異議之處須由雙方共同討論或咨詢第三方和相關(guān)專家解決。

四、文獻(xiàn)質(zhì)量評價

用紐卡斯?fàn)?渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale，NOS)評估回顧性研究的文獻(xiàn)質(zhì)量，滿分9分，0～4分為低質(zhì)量，5～9分為高質(zhì)量；Jadad量表評估隨機(jī)對照研究的文獻(xiàn)質(zhì)量，滿分7分，1～3分為低質(zhì)量，4～7分為高質(zhì)量。由2位研究者獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評價，如遇分歧，2位研究者通過討論解決或交由第三方裁決。評分結(jié)果見表1。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Stata 12.0 軟件(Stata Corp, College Station, TX, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。優(yōu)勢比(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)用于評估二分類變量。Q檢驗(yàn)及I2檢驗(yàn)用于評估各項(xiàng)研究之間的異質(zhì)性，若Q檢驗(yàn)P<0.1和(或)I2> 50%，則認(rèn)為文獻(xiàn)之間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行效應(yīng)量合并；反之則使用固定效應(yīng)模型。但研究間異質(zhì)性較大時，使用Meta回歸或(和)亞組分析探索異質(zhì)性來源。當(dāng)納入研究數(shù)>10時，采用Begg′s 和Egger′s檢驗(yàn)進(jìn)行發(fā)表偏移評估，P<0.05代表存在發(fā)表偏倚。

結(jié) 果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果

共納入18項(xiàng)研究，其中2項(xiàng)為隨機(jī)對照研究，16項(xiàng)為回顧性研究。各項(xiàng)研究基本資料，如基礎(chǔ)資料(研究類型、國家、患者例數(shù)/周期數(shù)、新生兒數(shù))、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)(促排卵類型、受精類型、培養(yǎng)基、移植時間)見表1、表2。回顧性研究NOS評分結(jié)果：9分1篇、8分3篇、7分8篇、6分4篇；2項(xiàng)隨機(jī)對照研究Jadad量表評分均為6分。

表1 各項(xiàng)研究基本資料

注：NA=不明確

表2 各項(xiàng)研究實(shí)驗(yàn)室資料

注：hMG=注射用尿促性素；r-FSH=重組卵泡刺激素；GnRH agonist=促性腺激素釋放激素激動劑；GnRH antagonist=促性腺激素釋放激素抑制劑；AH=輔助孵化；ICSI=卵胞漿內(nèi)單精子注射；D=天

二、Meta分析結(jié)果

1.MZT率：納入的18篇文獻(xiàn)中，3篇文獻(xiàn)的研究結(jié)果表明，卵裂期鮮胎移植有較高的MZT率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5,9,18]；15篇文獻(xiàn)的研究結(jié)果表明，囊胚期鮮胚移植有較高的MZT率[6-8,10-17,19-22]，其中6篇文獻(xiàn)顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8,10,13,15,19，21]。采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行效應(yīng)量合并，結(jié)果顯示，囊胚移植的MZT率顯著高于卵裂期胚胎移植(OR=0.42，95%CI：0.28～0.64，P<0.001)，研究間具有較大的異質(zhì)性(I2=68.3%，P<0.001)。見圖1。

2.亞組分析：對不同研究時期(2002年前和2002年后)、不同地域(亞洲、美洲和歐洲)以及不同類型(回顧性研究和隨機(jī)對照研究)的研究進(jìn)行亞組分析，結(jié)果表明，任何研究時期(無論是2002年前還是2002年后)，囊胚移植的MZT率均顯著高于卵裂期胚胎移植(OR=0.24，95%CI：0.14～0.42，P<0.001；OR=0.64，95%CI：0.51～0.81，P<0.001)，見圖2A；對于不同地域，亞洲和美洲人群囊胚移植的MZT率顯著高于卵裂期胚胎移植(OR=0.37，95%CI：0.17～0.83，P=0.015；OR=0.41，95%CI：0.23～0.74，P=0.003)，而歐洲人群囊胚移植的MZT率與卵裂期胚胎移植無明顯差異(OR=0.55，95%CI：0.11～2.75，P=0.469)，見圖2B；而對于不同類型的研究，在回顧性研究中，囊胚移植的MZT率顯著高于卵裂期胚胎移植(OR=0.41，95%CI：0.27～0.62，P<0.001)，而在隨機(jī)對照研究中兩者無明顯差異(OR=1.54，95%CI：0.13～18.97，P=0.735)，見圖2C。

圖1 囊胚期和卵裂期鮮胎移植MZT率的Meta分析森林圖

3.Meta回歸分析：由于各項(xiàng)研究之間存在較大的異質(zhì)性，因此，我們使用Meta回歸分析對異質(zhì)性的來源進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，研究發(fā)表年限為異質(zhì)性的主要來源(P<0.05)，可以解釋79.54%的異質(zhì)性。而研究地域、研究類型和文獻(xiàn)質(zhì)量評分對異質(zhì)性無明顯影響。見表3。

表3 Meta回歸分析

4.發(fā)表偏倚：采用Begg′s 和Egger′s檢驗(yàn)進(jìn)行發(fā)表偏倚分析，結(jié)果表明，納入研究間不存在發(fā)表偏倚(PBegg=0.951,PEgger=0.889)。

討 論

根據(jù)受精卵分裂時間的不同， MZT可分為單絨毛膜單羊膜囊型、單絨毛膜雙羊膜囊型、雙絨毛膜雙羊膜囊型以及聯(lián)體雙胎。與自然妊娠相比，ART顯著增加了MZT的風(fēng)險，且MZT易導(dǎo)致許多產(chǎn)科及新生兒并發(fā)癥，因此，已有許多研究對MZT發(fā)生的相關(guān)影響因素進(jìn)行了探討，如女方年齡、培養(yǎng)基成分、受精方式和移植胚胎類型等，但目前結(jié)論尚不一致。本項(xiàng)研究綜合分析不同研究數(shù)據(jù)，對新鮮周期中囊胚移植以及卵裂期胚胎移植的MZT率進(jìn)行了Meta分析，旨在為臨床方案的選擇提供更高級別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

A:研究時期；B研究地域；C：研究類型

圖2 不同研究時期、地域和研究類型囊胚期和卵裂期鮮胎移植MZT率的Meta分析森林圖

早前的Meta分析結(jié)果顯示，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植MZT率顯著增高[4]，然而，近期的一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究提示，在控制胚胎質(zhì)量指標(biāo)后，兩組患者的MZT率無顯著差異[19]。本項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植有較高的MZT率，這與之前的Meta分析結(jié)果一致[4]。為進(jìn)一步分析不同研究時期、不同地域和不同研究類型之間的差異，我們進(jìn)行了亞組分析，結(jié)果證實(shí)，任何研究時期(無論是2002年前還是2002年后)、亞洲和美洲人群以及回顧性研究中，囊胚移植的MZT率顯著高于卵裂期胚胎移植，而在歐洲人群和隨機(jī)對照研究中，兩者卻無明顯差異。我們的研究結(jié)果提示，ART的應(yīng)用和發(fā)展可能存在地域差異，而研究質(zhì)量的高低可能對研究結(jié)果存在一定程度的影響。

與自然妊娠相比，體外受精(IVF)及ICSI顯著增加MZT率[23]。動物研究表明，MZT可能導(dǎo)致表觀遺傳障礙，從而增加基因印記紊亂的發(fā)生率[24]；另外，MZT會導(dǎo)致胎兒先天性畸形、流產(chǎn)、生長受限、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常以及低出生體重[25-26]。前期研究證實(shí)，年齡<35歲的女性經(jīng)歷IVF/ICSI后發(fā)生MZT的幾率更大[13,19]，其他與MZT相關(guān)的因素包括：新鮮胚胎移植[27]、輔助孵化[28]以及囊胚移植[8,10,13,15,19]等，但是也有研究不支持這一相關(guān)性[5-6,29]。有學(xué)者認(rèn)為，囊胚移植增加MZT率是由于體外培養(yǎng)時間的延長，但也有學(xué)者認(rèn)為MZT率的增加是培養(yǎng)環(huán)境的變化，而非培養(yǎng)時間的延長[30]。例如，培養(yǎng)基中的高糖環(huán)境以及產(chǎn)生的氧自由基可能誘導(dǎo)凋亡，從而導(dǎo)致內(nèi)細(xì)胞團(tuán)破裂；培養(yǎng)基中低鈣環(huán)境會使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分子內(nèi)氫鍵不穩(wěn)定，從而分裂[31];而生長因子，如胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2則可能干擾胚胎的胞質(zhì)轉(zhuǎn)變、信號和極性的變化[19,32]。Moayeri等[14]的研究也側(cè)面證實(shí)了這一觀點(diǎn)，即隨著囊胚培養(yǎng)體系的不斷完善，MZT率逐漸下降。

此外，本研究所納入的文獻(xiàn)之間存在較大的異質(zhì)性(I2=68.3%，P<0.001)，而不同發(fā)表年限則是異質(zhì)性的主要來源(Coef.= 0.083，P=0.009)。事實(shí)上，從2002年起，囊胚序貫培養(yǎng)技術(shù)開始在ART中廣泛應(yīng)用，有力地促進(jìn)了囊胚移植技術(shù)在鮮胚移植中的發(fā)展，這從一定程度上導(dǎo)致了2002年前后研究之間的異質(zhì)性。

本研究通過綜合既往不同類型研究，并在清楚探索出異質(zhì)性來源的基礎(chǔ)上，利用Meta分析方法定量合并各研究間的效應(yīng)值，達(dá)到類似于大樣本、多中心的臨床對照試驗(yàn)的效果，進(jìn)而得出相對可靠的結(jié)論。然而，本研究也存在一定缺陷：①各項(xiàng)研究之間胚胎移植的時間不一致; ②納入的研究多數(shù)為回顧性研究，高質(zhì)量的前瞻性隨機(jī)對照研究數(shù)目較少，可能影響研究結(jié)果的可信度；③各項(xiàng)納入研究之間患者的年齡及移植胚胎數(shù)目存在差異，影響結(jié)果的一致性。另外，本項(xiàng)Meta分析未納入身體質(zhì)量指數(shù)、男方/女方吸煙史、家族史等參數(shù)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了在鮮胚移植中，囊胚移植較卵裂期胚胎移植有更高的MZT發(fā)生率，臨床醫(yī)生在具體的臨床實(shí)踐中應(yīng)注意移植方式的選擇。然而，關(guān)于兩種移植方式對MZT率的影響仍需要更高質(zhì)量、大樣本、多中心的隨機(jī)對照研究來加以證實(shí)。