張保龍 馬利閣 尹萬樂 李 達 宗淑君 王 芳 段小珍 尤笑迎

(鄭州人民醫(yī)院骨三科，河南 鄭州 450000)

骨肉瘤是一種多發(fā)于青少年或兒童的惡性骨腫瘤，發(fā)病率高，易轉移和復發(fā)〔1，2〕。目前常用的治療方法是手術、化療、放療等，但預后較差，其主要原因是出現(xiàn)遠端轉移和復發(fā)〔3，4〕。骨肉瘤細胞的侵襲、遷移受多種轉移基因的影響，但其轉移的分子機制尚不完全清楚。研究表明，B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2在骨肉瘤組織中的表達量高于正常組織，對骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用〔5〕。本實驗擬分析下調Bcl-2基因對骨肉瘤細胞侵襲、遷移能力的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗主要試劑及儀器 人骨肉瘤細胞系MG-63購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國HyClone公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，胰蛋白酶、Matrigel基質膠、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海Solarbio公司，RIPA裂解液購自南京碧云天生物技術有限公司，細胞培養(yǎng)板、Transwell小室購自美國Costar公司，Bcl-2抗體、β-連環(huán)蛋白(catenin)抗體、c-Myc抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，β肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自美國Cell signaling公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，凝膠成像儀購自上海天能凝膠成像系統(tǒng)公司。

1.2細胞培養(yǎng) 將MG-63凍存管取出，在37℃水浴鍋中溶化30 s，加入5 ml DMEM培養(yǎng)基，離心，收集細胞至培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。每天在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。待細胞生長匯合度達80%左右，加入胰酶消化細胞，進行傳代，每隔2 d傳代1次。

1.3細胞轉染 轉染前1 d，選取生長狀態(tài)良好的對數期細胞，消化、離心，加入不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，每孔5×105個細胞接種于6孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%左右開始轉染。將500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基和2 ml siRNA-NC(50 nmol/L)或siRNA-Bcl-2(50 nmol/L)混勻，加入LipofectamineTM2000，室溫靜置20 min，將混合液加入6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，更換完全培養(yǎng)基，48 h后進行其他實驗。實驗分為空白組、MG-63 NC組(轉染siRNA-NC)和MG-63-siRNA組(轉染siRNA-Bcl-2)，Western印跡檢測轉染效果。

1.4Transwell法檢測細胞遷移能力 0.25%胰酶消化對數期細胞，200 μl不含血清的培養(yǎng)基和1×104個細胞接種到Transwell小室中，將小室置于24孔板中，加入500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基于24孔板中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗小室，棉簽輕輕拭去小室中的細胞，1%甲醇固定小室細胞10 min，蘇木精染色5 min，在倒置顯微鏡下觀察穿過濾膜表面的細胞，每組5個復孔，選取5個視野，取平均值，實驗重復3次。

1.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 實驗前，將Matrigel基質膠融化為液體，以1∶9的比例加入無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，加入50 μl稀釋好的Matrigel膠包被Transwell小室底部，37℃通風3 h，細胞提前使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，0.25%胰酶消化對數期細胞，將1×104個細胞接種到Matrigel膠包被的Transwell小室中，24孔板中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棉簽擦去小室中的細胞，使用1%甲醇固定10 min，蘇木精浸泡5 min，取5個視野，觀察細胞的數量，每組5個復孔，取平均值。

1.6Western印跡檢測細胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達水平 胰酶消化細胞，將細胞密度調整為1×106個/ml，加入200 μl預冷的細胞裂解液，在冰上放置15 min，離心，取上清，考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。取50 μg蛋白上樣緩沖液混合均勻，置于沸水中變性5 min。將10%的分離膠加入凝膠玻璃板中間，配置6%的濃縮膠，加入樣品蛋白，80 V電泳至樣品進入濃縮膠，調整電壓至100 V，待溴酚藍遷移至分離膠底部，停止電泳。切下目的蛋白條帶，加入電泳緩沖液，將蛋白質轉移至NC膜上。將轉膜后獲得的BC膜置于10 ml 5%脫脂牛奶封閉1 h。加入1%脫脂牛奶稀釋的一抗，4℃過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗3～4次，每次5～10 min，加入適量稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，37℃結合2 h，TBST洗膜3～4次，每次5～10 min。暗室中與顯影液反應1 min，定影10～15 min，清水沖洗晾干，以β-actin為對照，凝膠成像儀分析目的蛋白的表達量。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1siRNA-Bcl-2轉染后骨肉瘤細胞中Bcl-2的表達 Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，MG-63-siRNA組Bcl-2蛋白表達量(0.352±0.066)明顯低于空白組(0.684±0.074，P<0.05)，而MG-63 NC組(0.701±0.083)和空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 siRNA-Bcl-2轉染后骨肉瘤細胞中Bcl-2的表達

2.2干預Bcl-2基因表達對骨肉瘤細胞遷移能力的影響 MG-63-siRNA組穿過Transwell小室的細胞數〔(43.852±3.752)個〕較空白組〔(82.489±6.522)個〕顯著降低(P<0.05)，而MG-63 NC組〔(85.487±4.123)個〕與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3干預Bcl-2基因表達對骨肉瘤細胞侵襲能力的影響 MG-63-siRNA組細胞的侵襲數目〔(13.225±1.658)個〕較空白組〔(45.685±2.289)個〕顯著降低(P<0.05)，而MG-63 NC組〔(42.587±3.145)個〕與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4干預Bcl-2基因表達對骨肉瘤細胞中β-catenin、c-Myc蛋白水平的影響 與空白組相比，MG-63 NC組β-catenin、c-Myc蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；MG-63-siRNA組顯著降低(P<0.05)，見表1，圖2。

圖2 干預Bcl-2基因表達對骨肉瘤細胞中β-catenin、c-Myc蛋白水平的影響

組別β-catenin/β-actinc-Myc/β-actin空白組1.202±0.3641.252±0.326MG-63 NC組1.336±0.2981.120±0.341MG-63-siRNA組0.574±0.0851)0.462±0.0781)

與空白組比較：1)P<0.05

3 討 論

骨肉瘤是一種發(fā)病率高、致殘率高的惡性腫瘤，由于具有較高的侵襲和遷移能力，患者預后較差〔6〕。常見的骨肉瘤治療方式是手術結合放化療，但治療效果并不滿意，主要原因是骨肉瘤存在早期轉移，多見于肺部轉移〔7，8〕。腫瘤的轉移是一個復雜的過程，由多種細胞、促轉移基因、抑制轉移基因共同參與〔9，10〕。促轉移基因主要促進腫瘤細胞的侵襲、遷移能力，抑制轉移基因主要抑制腫瘤細胞的的侵襲、遷移能力。機體在正常生理狀態(tài)下，促轉移基因和抑制轉移基因處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但當機體發(fā)生病理性變化時，促轉移基因和抑制轉移基因的動態(tài)平衡處于紊亂狀態(tài)，影響腫瘤細胞的侵襲、遷移能力。既往研究表明，Bcl-2能通過調節(jié)細胞的凋亡能力影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔11〕。本實驗結果顯示，轉染siRNA Bcl-2后，細胞中Bcl-2的水平明顯下調，而且Bcl-2表達量下降的MG-63細胞的侵襲、遷移能力顯著降低。

Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的Wnt經典通路，調控細胞的各種生命活動〔12〕。在胚胎發(fā)育中，Wnt/β-catenin信號通路參與調節(jié)細胞及重要器官的生長、分化；在成熟個體中，Wnt/β-catenin信號通路參與細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程〔13〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中重要因子，其表達量水平影響Wnt/β-catenin信號通路的活性。當β-catenin表達量降低時，Wnt信號通路處于未激活狀態(tài)；當β-catenin水平累積增高，可促進細胞質中的β-catenin進入細胞核中，激活Wnt信號通路，調控下游靶基因的轉錄和表達〔14〕。研究表明Wnt/β-catenin信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，其通路的異?；罨纱龠M下游靶基因c-Myc、細胞周期蛋白(cyclin)D1等的表達，調控腫瘤細胞的生長、分化、侵襲、遷移〔15，16〕。本研究結果提示干預Bcl-2可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶基因c-Myc表達降低MG-63骨肉瘤細胞的侵襲、遷移能力。