孟 杰 劉云霞 吳曉光 李蒙蒙 仇志富 孫大永

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

腦出血可導(dǎo)致組織發(fā)生神經(jīng)元凋亡，抑制細(xì)胞凋亡可以保護(hù)腦損傷〔1〕。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是臨床上用于治療腦缺血后遺癥的常用藥物，具有抗氧化，提高微血管密度，增加腦組織血流量，抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)再生等作用〔2～4〕，然而其對(duì)出血腦組織細(xì)胞凋亡的影響卻鮮有報(bào)道。本研究觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血模型大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑 雄性、成年SD大鼠96只，體重240～280 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯(同仁堂承德分公司，批號(hào)：2015134)，銀杏葉片(北京雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20151013)；兔抗大鼠多克隆抗體Bax、Bcl-2(上海延生實(shí)業(yè)有限公司)； 轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.2模型制作、分組 將大鼠編號(hào)及記錄體重，按照Rosenberg法〔5〕制備腦出血模型，造模后第2天開始，分別灌胃給予假手術(shù)組(等量生理鹽水)、模型組(等量生理鹽水)、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(26 g·kg-1·d-1)和銀杏葉片組(3.5 mg·kg-1·d-1)，灌胃14 d。按照隨機(jī)每組24只分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、銀杏葉片組。

1.3神經(jīng)功能障礙評(píng)分 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分采用雙盲、Garcia〔6〕法。

1.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)凋亡。

1.5免疫組化檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá) 腦組織切片(5 μm)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法免疫組化染色，兔抗大鼠一抗Bax(1∶100)、Bcl-2(1∶150)。圖像處理軟件(Image pro plus5.01)分析切片，每組6張，每張選取6個(gè)不同視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)積分光密度值(IOD)。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)的表達(dá) 提取蛋白，定量，每組按照 30 μg 總蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，傾去封閉液，滴加稀釋好的一抗p-ERK(1∶60)孵育3 h(室溫)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜3次，每次5 min，再滴加二抗，溫箱內(nèi)孵育1 h(37℃)，同法洗膜3次，暗室內(nèi)用電化學(xué)發(fā)光(ELC)液顯影，最后用Quantity One軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠造模后6 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，模型組出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，無(wú)法攀援、追尾，站立不穩(wěn)，左側(cè)肢體無(wú)力等現(xiàn)象；神經(jīng)功能評(píng)分〔(8.24 ±1.56)分〕顯著低于假手術(shù)組〔(17.32 ±0.76)分〕(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和銀杏葉片兩組評(píng)分顯著升高〔(12.85±1.62)、(13.01±1.54)分〕(P<0.05)。

2.2TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化 假手術(shù)組大腦皮質(zhì)內(nèi)僅有零星的、散在的TUNEL陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。模型組腦出血組織內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和銀杏葉片組陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少(P<0.05)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和銀杏葉片組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表1。

2.3免疫組化檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá) 神經(jīng)元胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。假手術(shù)組中Bax、Bcl-2的表達(dá)很少。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和銀杏葉片組與模型組相比，Bax表達(dá)量明顯降低，Bcl-2增加，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與銀杏葉片組Bcl-2/Bax比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表1。

2.4Western印跡檢測(cè)p-ERK蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組p-ERK蛋白表達(dá)有所增加；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和銀杏葉片組與模型組相比，p-ERK表達(dá)增加(P<0.05)，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯誘導(dǎo)p-ERK表達(dá)增加，可能激活下游PI3K/ERK信號(hào)通路。見表1和圖3。

圖1 TUNEL法檢測(cè)各組腦出血組織中細(xì)胞凋亡的表達(dá)(×400)

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腦出血組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(×400)

組別p-ERK(灰度值)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(個(gè)/視野)Bcl-2(個(gè)/視野)Bax(個(gè)/視野)Bcl-2/Bax(個(gè)/視野)假手術(shù)組5.37±1.260.96±0.055.47±1.754.32±1.721.26±1.02模型組6.81±1.291)6.13±2.511)9.18±2.241)16.81±4.351)0.55±0.521)補(bǔ)陽(yáng)還五湯組9.78±1.312)3.67±1.282)16.81±4.232)12.17±2.642)1.38±1.602)銀杏葉片組9.32±1.472)4.12±1.642)15.28±3.942)11.28±2.572)1.35±1.532)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

圖3 各組血腫周圍腦組織p-ERK蛋白表達(dá)

3 討 論

腦出血后血腫周圍腦組織神經(jīng)元凋亡的調(diào)控通路主要為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在這一通路中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)具有抗凋亡作用，研究表明,ERK在腦缺血后損傷神經(jīng)的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔7〕。ERK是MAPK信號(hào)通路的重要成員，具有調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化和調(diào)節(jié)炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)的作用〔8〕。ERK是MAPK家族的蛋白激酶，主要在細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，在Raf-1因子的參與下可轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，活化成p-ERK。p-ERK 的激活即可以通過(guò)激活蛋白激酶(PK)A信號(hào)通路抑制Bad/Bcl-xL二聚合物的形成，也可以抑制Bad蛋白表達(dá)，從而可以阻斷細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡〔9〕。Bcl-2通過(guò)阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，而細(xì)胞凋亡是被認(rèn)為引起腦出血后神經(jīng)功能缺損最重要的機(jī)制〔10〕。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bad 等蛋白，其中Bcl-2和Bcl-xL蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax和Bad 等蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用〔11〕。位于線粒體膜上的Bcl-2/Bax蛋白，調(diào)控線粒體功能和凋亡相關(guān)蛋白的釋放，Bcl-2在Bax和Bcl-2形成異源二聚體時(shí)，發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能。本研究結(jié)果顯示，中藥補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥后大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少，神經(jīng)功能明顯改善。

綜上，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以保護(hù)腦出血誘發(fā)的神經(jīng)元

損傷，機(jī)制與降低Bax蛋白表達(dá)并增加Bcl-2表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值而抑制神經(jīng)元凋亡可能有關(guān)。