佐合拉古麗·木塔力甫 阿依努爾·色義提

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科放射治療二病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830011)

目前隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的不斷推廣，宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但仍然嚴(yán)重威脅女性的健康〔1〕。宮頸癌的治療以手術(shù)治療為主，由于大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，放化療已成為最為常用的輔助治療方法。轉(zhuǎn)錄因子(TCF)-21是一種抑癌基因，在肝癌、卵巢癌、胃癌等癌組織中表達(dá)下調(diào)，能夠影響腫瘤的生長(zhǎng)〔2，3〕。有研究表明，TCF-21過表達(dá)后，肺腺癌細(xì)胞放化療敏感性均增加，細(xì)胞凋亡增多〔4〕。蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)，且能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的放療敏感性〔5〕。本研究旨在探討TCF-21對(duì)宮頸癌細(xì)胞放療敏感性及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1組織及細(xì)胞 收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院在2015年1月至2017年2月收治的70例宮頸癌患者的宮頸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，所有患者在切除手術(shù)前沒有接受放療及化療，組織標(biāo)本保存于液氮中，標(biāo)本采集均經(jīng)過患者及家屬知情同意。宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki、SiHa和正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要儀器及試劑 胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco；K-SFM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)Sigma；TCF-21和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海生工合成；pcDNA3.1空載體、TCF-21過表達(dá)載體(pcDNA3.1 TCF-21)均購(gòu)于山東維真生物科技有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單克隆抗體、Akt單克隆抗體、磷酸化Akt(p-Akt)單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz；紫外分光光度計(jì)、CO2培養(yǎng)箱均購(gòu)于美國(guó)Thermo；RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連Takara；組織和蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；Lip2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki、SiHa用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7用含有10%胎牛血清、0.1 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子的K-SFM培養(yǎng)液在37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度超過90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.4qRT-PCR檢測(cè)組織和細(xì)胞中TCF-21 mRNA表達(dá)水平 RNA提?。簩m頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki、SiHa和正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按照每10 cm2細(xì)胞加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞；宮頸癌組織及癌旁組織液氮研磨成粉狀，按照每50 mg加入1 ml Trizol裂解組織。將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，放在室溫環(huán)境下靜置5 min，加入200 μl氯仿，上下劇烈振蕩15 s，室溫環(huán)境中靜置5 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至EP管中，加入500 μl異丙醇，混勻后，室溫靜置10 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，加入75%乙醇洗滌2次后，在室溫環(huán)境中干燥。吸取1 μl用于檢測(cè)RNA濃度及純度(紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度)。根據(jù)qRT-PCR試劑盒檢測(cè)TCF-21 mRNA水平。TCF-21上游引物5′-GGCAGATCCTGGCTAACGAC-3′，下游引物5′-CCTTTCCCAGACTCGCACC-3′。GAPDH上游引物5′-GGCAGATCCTGGCTAACGAC-3′，下游引物5′-CCTTTCCCAGACTCGCACC-3′。循環(huán)參數(shù)：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，2-△△Ct法計(jì)算TCF-21 mRNA水平。

1.5Western印跡檢測(cè)組織和細(xì)胞中TCF-21蛋白表達(dá)水平 按照蛋白提取試劑盒提取宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki、SiHa和正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7、癌旁組織及宮頸癌組織中的蛋白。蛋白樣品濃度參照BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。取蛋白樣品與5倍上樣緩沖液按照4∶1的比例混合后，煮沸變性。按照每孔加入40 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，72 V電壓觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠邊緣時(shí)，把電壓升高至120 V，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入膠塊下端邊緣1 cm處，終止電泳。35 V電壓轉(zhuǎn)膜過夜。用含有5%牛血清白蛋白在室溫，搖床封閉2 h。與500倍稀釋的一抗在4℃孵育過夜后，與2 000倍稀釋的二抗在室溫環(huán)境中孵育90 min。顯色后，用目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 SiHa細(xì)胞分為對(duì)照組、陰性組和過表達(dá)組，其中對(duì)照組不做處理，陰性組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體，過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TCF-21過表達(dá)載體(pcDNA3.1 TCF-21)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育1 h，用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1和pcDNA3.1 TCF-21轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。48 h后，RT-PCR和Western印跡分別檢測(cè)細(xì)胞中TCF-21 mRNA和蛋白水平。步驟參照1.4和1.5。將轉(zhuǎn)染48 h后的SiHa細(xì)胞以6 MV光子線，100 cm源皮距，10 cm×10 cm照射野，劑量8 Gy放射處理。對(duì)照組細(xì)胞照射處理后為對(duì)照+放療組，過表達(dá)組細(xì)胞照射處理后為過表達(dá)+放療組。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、過表達(dá)組、對(duì)照+放療組、過表達(dá)+放療組處理后培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集9×105個(gè)細(xì)胞，用200 μl結(jié)合緩沖液重懸，加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI) 各5 μl，混勻，放置室溫環(huán)境下孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放療敏感性 對(duì)照組、過表達(dá)組培養(yǎng)48 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有3×106個(gè)細(xì)胞。接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0、2、4、6、8 Gy劑量照射處理細(xì)胞后，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13 d。用肉眼觀察細(xì)胞克隆形成后，將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次細(xì)胞，固定(甲醇，20 min)，染色(結(jié)晶紫，20 min)，用蒸餾水將染液沖洗掉，在顯微鏡下觀察大于50個(gè)的細(xì)胞克隆數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，擬合存活曲線。細(xì)胞克隆率=克隆數(shù)量÷接種的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=受照射的細(xì)胞克隆形成率÷對(duì)照細(xì)胞的克隆形成率，放射增敏比(SER)=(對(duì)照組D0/藥物處理組D0)。

1.9Western印跡檢測(cè)酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 對(duì)照組、過表達(dá)組、對(duì)照+放療組、過表達(dá)+放療組處理后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按照1.5中步驟檢測(cè)酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TCF-21在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá) TCF-21 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平(0.36±0.04，0.11±0.03)明顯低于癌旁組織(1.00±0.09，0.35±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.320，8.314，P<0.05)。End1/E6E7、HeLa、CaSki、SiHa細(xì)胞中mRNA水平(1.00±0.11、0.46±0.03、0.34±0.03、0.22±0.02)和蛋白水平(0.42±0.03、0.23±0.02、0.14±0.02、0.07±0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.441，153.111，均P=0.000)，TCF-21 mRNA和蛋白在宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki、SiHa中的表達(dá)水平均明顯低于正常宮頸上皮細(xì)胞End1/E6E7(P<0.05)，且在SiHa細(xì)胞中表達(dá)最低。后續(xù)選用SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象。見圖1，圖2。

圖1 TCF-21在宮頸癌組織中的表達(dá)

圖2 TCF-21在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TCF-21水平 對(duì)照組、陰性組、過表達(dá)組TCF-21 mRNA水平(1.00±0.08、1.01±0.12、2.17±0.14)和蛋白水平(0.10±0.02、0.09±0.04、0.58±0.06)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=100.790，126.054，均P=0.000)，陰性組mRNA和蛋白水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)組均明顯高于對(duì)照組(t=12.348，13.607，P<0.05)。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TCF-21表達(dá)水平

2.3TCF-21對(duì)細(xì)胞凋亡影響 對(duì)照組、過表達(dá)組、對(duì)照+放療組、過表達(dá)+放療組細(xì)胞凋亡率〔(8.77±2.58)%、(41.81±3.40)%、(36.63±2.63)%、(55.47±3.13)%〕差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=132.180，P=0.00)，對(duì)照+放療組、過表達(dá)組、過表達(dá)+放療組明顯高于對(duì)照組(t=11.547，13.694，19.355，P<0.05)。過表達(dá)+放療組明顯高于對(duì)照+放療組(t=7.808，P<0.05)。

2.4放療敏感性 過表達(dá)TCF-21能夠降低細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，提高放療敏感性，SER為1.661。見圖4，表1。

圖4 細(xì)胞存活曲線

組別D0(Gy)Dq(Gy)NSF2kSER對(duì)照組2.0842.1942.8660.7490.480-過表達(dá)組1.2551.3482.9290.4860.7971.661

2.5細(xì)胞中酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白水平 4組酶切Caspase-3水平和p-Akt水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=65.427，45.114，均P=0.000)，而Akt水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.233，P=0.871)，對(duì)照+放療組、過表達(dá)組、過表達(dá)+放療組酶切Caspase-3水平明顯高于對(duì)照組(t=3.062，3.242，13.147，P<0.05)，過表達(dá)+放療組明顯高于對(duì)照+放療組(t=10.085，P<0.05)。對(duì)照+放療組、過表達(dá)組、過表達(dá)+放療組p-Akt水平明顯低于對(duì)照組(t=5.383，4.968，11.593，P<0.05)，過表達(dá)+放療組明顯低于對(duì)照+放療組(t=6.211，P<0.05)。見圖5，表2。

圖5 Western印跡檢測(cè)酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白水平

組別酶切Caspase-3Aktp-Akt對(duì)照組0.25±0.061.05±0.070.38±0.04過表達(dá)組0.43±0.061)1.08±0.060.26±0.031)對(duì)照+放療組0.42±0.071)1.09±0.040.25±0.031)過表達(dá)+放療組0.98±0.081)2)1.07±0.070.10±0.011)2)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與對(duì)照+放療組比較:2)P<0.05

3 討 論

TCF-21基因定位于6q23-24，是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員之一，能夠編碼TCF-21，其在肺、腸、腎等均廣泛表達(dá)〔6〕。最近的研究表明，TCF-21在多種癌癥如腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤、頭頸鱗狀細(xì)胞癌等組織中表達(dá)異常下調(diào)，且與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性有關(guān)〔7～9〕。胡松等〔10〕研究表明，TCF-21能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。Tan等〔11〕發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到TCF-21 mRNA和蛋白，而過表達(dá)TCF-21后肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡率從12%上升至50%。朱清華〔12〕研究表明，TCF-21 mRNA和蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常的卵巢組織。本研究結(jié)果說明，TCF-21在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，可能是一種抑癌基因。

放療是目前治療腫瘤較為常用的輔助治療手段，通過靶向基因提高腫瘤細(xì)胞放療敏感性是目前較為常用的提高放療敏感性的方法〔13〕。陸曉等〔14〕研究表明，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549中TCF-21表達(dá)后，通過放射處理后，裸鼠成瘤體積減少一半，細(xì)胞凋亡增多。本研究結(jié)果提示TCF-21能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，增加宮頸癌細(xì)胞放療敏感性。

腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞多種基因的嚴(yán)格調(diào)控有關(guān)，是一系列蛋白經(jīng)過復(fù)雜調(diào)控的最終結(jié)果〔15〕。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活后能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中Caspase-3發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用，其活化后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段〔16，17〕。Akt信號(hào)通路在多種組織和器官中均存在廣泛的生物學(xué)作用，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等過程〔18，19〕。在腫瘤組織中，Caspase-3活化水平受到抑制，P-Akt水平異常升高，Akt信號(hào)通路過度激活〔20〕。Zhang等〔21〕研究表明，Akt信號(hào)通路參與miRNA調(diào)控肝癌細(xì)胞放療敏感性的過程。本研究結(jié)果提示，TCF-21可能通過抑制Akt信號(hào)通路增加宮頸癌細(xì)胞放療敏感性，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

綜上，TCF-21在宮頸癌組織和細(xì)胞中無論是在基因水平還是蛋白水平均明顯下調(diào)。TCF-21能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，且對(duì)放療誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用，能夠增加宮頸癌細(xì)胞放療敏感性。