吳志賢， 曾達武， 林 蘇， 朱月永， 劉豫瑞

DNA結(jié)合/分化抑制蛋白-1(inhibitor of differentiation/ DNA binding-1，Id-1)屬于Id家族，是參與腫瘤形成的重要基因之一[1]。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)傳導途徑中最重要的一條信號通路，是一種與細胞增殖、轉(zhuǎn)化和分化等細胞反應(yīng)有關(guān)的胞內(nèi)關(guān)鍵酶。在前期的體外實驗中，本課題組采用針對Id-1特異的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞系，隨著Id-1的沉默，ERK1/2 mRNA及其蛋白和p-ERK1/2蛋白均被有效抑制，推測Id-1基因可能通過激活ERK1/2信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-3]。近年來，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)已成為研究基因功能的重要工具，本研究通過構(gòu)建Id-1特異siRNA的慢病毒表達載體，穩(wěn)定沉默Id-1表達，在體內(nèi)環(huán)境進一步觀察Id-1對肝癌HepG2細胞系裸鼠皮下移植瘤增殖的影響，分析Id-1與ERK1/2信號通路的關(guān)系及ERK1/2信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細胞株HepG2細胞(上?？茖W院細胞中心)；Id-1-RNAi-Lentivirus(Biomiga上海技術(shù)服務(wù)中心)；siRNA-Id-1及Lipofectamine 2000(廣州銳博生物公司)；Trizol Reagent(美國Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(美國Fermentas公司)；鼠抗人ERK1/2單克隆抗體、兔抗人Id-1多克隆抗體及Western印跡熒光試劑(美國Santa Cruz公司)；兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體(美國Bioworld公司)；雙目倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；實時熒光定量PCR儀(ABI7700，美國ABI公司)；MTT(廈門泰京生物有限公司)；Id-1，ERK1/2及β-actin的PCR引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.1.2動物 清潔級BALA/c nu/nu裸鼠18只，雄性，4～6周齡，16～18 g，購于上海腫瘤動物研究中心[許可證號SCXK(滬)2007-0001]。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構(gòu)建與病毒滴度測定 委托Biomiga上海技術(shù)服務(wù)中心制備，5個Id-1 shRNA Sets(以細菌狀態(tài)保存)的設(shè)計與合成購自美國Thermo Scientific公司，其中sh31系列為CCGGACTCGGAATCCGAAGTTGGAACTCG。使用轉(zhuǎn)染試劑Gene Tran將Id-1 shRNA或綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)慢病毒載體與包裝載體共轉(zhuǎn)染到293FT細胞中，培養(yǎng)48 h后，收集上清液，濃縮后得到慢病毒濃縮液。將293FT細胞按照每孔5×104的濃度接種Hela細胞，將所收集的慢病毒濃縮液分別按照對數(shù)級稀釋，將4 μL稀釋后的病毒上清液分別加入相應(yīng)的孔中，過夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)液，經(jīng)過1周的篩選后，于顯微鏡下計數(shù)熒光陽性細胞數(shù)，計算病毒濃度，篩選最優(yōu)靶點后進行病毒大量包裝。

病毒滴度(TU/mL)=克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)

1.2.2重組慢病毒感染HepG2細胞 使用2倍稀釋的慢病毒溶液轉(zhuǎn)導(MOI值約等于1)，慢病毒溶液用DMEM稀釋，在含2 mL培養(yǎng)基的6 cm平皿中,使用轉(zhuǎn)染試劑Gene Tran將Id-1 shRNA及GFP慢病毒載體與包裝載體共轉(zhuǎn)染到293FT細胞中，靜置孵育(體積分數(shù)為0.05的CO2、37 ℃)48 h后，用4 d的時間使用1 μg/mL嘌呤霉素篩選已轉(zhuǎn)導的HepG2細胞，得到5個Id-1基因沉默和GFP慢病毒穩(wěn)定表達的HepG2細胞系，并根據(jù)顯微鏡下存活細胞的數(shù)量粗略估計慢病毒的轉(zhuǎn)染效率，熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的GFP表達情況。

1.2.3半定量RT-PCR篩選Id-1最佳沉默效果的穩(wěn)定表達HepG2細胞系 收集上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系和未轉(zhuǎn)導的HepG2細胞并進行總RNA提取。Id-1引物通過Primer Express軟件(2.0版)設(shè)計，長度80 bp(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成)：

上游：5′-TGCTGCTCTACGACATGAACG-3′

下游：5′-TGCTGGAGAATCTCCACCTTG-3′

反轉(zhuǎn)錄使用SuperScript II kit(美國Invitrogen公司)試劑盒，50 μL反應(yīng)體系中加2 μg總RNA模板。PCR進行40個擴增循環(huán)，循環(huán)條件為第1輪95 ℃ 10 min，隨后40個循環(huán)為95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min。使用2-ΔCt法進行基因表達水平的相對定量，以管家基因GAPDH RNA的Ct值為準，校正同一樣本的模板起始濃度的差異。

1.2.4體內(nèi)實驗 18只BALA/c裸鼠隨機分為3組，每組6只。分別收集轉(zhuǎn)染實驗組、陰性對照組和空白對照組細胞，以5×106mL-1的濃度接種于裸鼠皮下，每只0.2 mL。每周用游標卡尺測量裸鼠腫瘤的最長徑及最短徑。

制作生長曲線并計算實驗組腫瘤抑瘤率(inhibitory rate，IR)。4周后處死裸鼠，取出瘤體組織稱質(zhì)量，多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片(2片)，行常規(guī)H-E染色后行組織學觀察，余組織保存?zhèn)溆谩?/p>

腫瘤體積(mm3)=1/2×A×B2(A、B分別為腫瘤的最大徑和最小徑)

1.2.5RT-PCR檢測腫瘤組織中Id-1及ERK 1/2 mRNA的表達 每種腫瘤組織取100 g提取總RNA。94 ℃預變性5 min，擴增94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，最終延伸72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物均保存于4 ℃的冰箱中。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度比值表示(對目的基因的表達進行半定量分析)，記錄Id-1，ERK 1/2與β-actin的吸光度值，再分別計算二者比值。

目的基因的表達指數(shù)=目的基因條帶的積分密度值/相應(yīng)β-actin條帶的積分密度值

1.2.6Western-blot法檢測腫瘤組織中Id-1，ERK 1/2及p-ERK 1/2蛋白的表達水平 腫瘤組織提取總蛋白后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST封閉30 min，后用一抗[Id-1抗體(1∶200)，ERK 1/2(1∶200)，p-ERK 1/2(1∶500)]4 ℃孵育過夜，加入第二抗體，室溫孵育40 min，加ECL化學發(fā)光劑1 mL，以β-actin為內(nèi)參，凝膠掃描儀采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒感染效率及最佳穩(wěn)定細胞系 采用MOI=1的慢病毒上清液轉(zhuǎn)染4 d后，熒光顯微鏡下觀察慢病毒RNAi上GFP的表達(綠色熒光)，得到約80%穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細胞(圖1)。半定量RT-PCR篩選6個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，sh31穩(wěn)定細胞系目的基因的表達比未轉(zhuǎn)染的HepG2細胞降低了60%左右，而與GFP穩(wěn)定表達細胞系相比，降低了80%以上，是干擾效率最佳的穩(wěn)定細胞系。

2.2Id-1-RNAi-Lentivirus對肝癌HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學和細胞凋亡的影響 常規(guī)H-E染色顯示，腫瘤細胞呈大片狀壞死，空泡性變，多數(shù)細胞核完全溶解，細胞結(jié)構(gòu)消失，呈均質(zhì)、紅染表現(xiàn)，可見多數(shù)凋亡細胞，細胞質(zhì)濃縮，細胞核深染固縮(圖2)。

A：轉(zhuǎn)染前HepG2細胞形態(tài)；B：轉(zhuǎn)染Id-1-RNAi-Lentivirus后的細胞形態(tài)；C：轉(zhuǎn)染GFP-Lentivirus后的細胞形態(tài).圖1 轉(zhuǎn)染Id-1-RNAi-Lentivirus及GFP-Lentivirus前后的肝癌HepG2穩(wěn)定細胞系( ×400)Fig 1 HepG2 cell line before and after transfection of Id-1-RNAi-Lentivirus and GFP-Lentivirus( ×400)

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：轉(zhuǎn)染實驗組.圖2 各組裸鼠皮下腫瘤組織常規(guī)染色檢查結(jié)果(H-E ×400)Fig 2 The pathological results of tumor in different groups (H-E ×400)

2.3Id-1-RNAi-Lentivirus對肝癌HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 接種人肝癌HepG2細胞系后，成瘤率100%。接種成瘤后，轉(zhuǎn)染實驗組腫瘤生長速度明顯慢于空白對照組及陰性對照組，空白對照組及陰性對照組的腫瘤體積增長迅速，每周測量均有增大，二者差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染實驗組的腫瘤體積增長較為緩慢，腫瘤增長被有效抑制，與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。實驗結(jié)束時，轉(zhuǎn)染實驗組與陰性對照組、空白對照組皮下瘤體質(zhì)量比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。轉(zhuǎn)染實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，腫瘤抑制率分別為70.6%及68.4%，而空白對照組與陰性對照組的腫瘤體積增長迅速，差別無統(tǒng)計學意義(表3)。

表2 成瘤后各組裸鼠皮下腫瘤的體積變化

n=6. 與空白對照組比較，☆：P<0.01；與陰性對照組比較，△：P<0.01.

與空白對照組及陰性對照組比較，☆：P<0.001.圖3 成瘤4周后各組裸鼠皮下瘤體的質(zhì)量比較Fig 3 Comparison of tumor weights on 4 weeks after subcutaneous transplantation

表3轉(zhuǎn)染實驗組相較于陰性對照組及空白對照組的腫瘤抑制率

Tab3Comparison of tumor inhibition rate between transfected group and control group

分 組V4周后皮下腫瘤/mm3IR/%轉(zhuǎn)染實驗組728.8±112.1陰性對照組2 478.5±359.770.60空白對照組2 304.0±253.668.40

n=6.

2.4半定量RT-PCR檢測各組腫瘤組織中Id-1及ERK1/2 mRNA的表達 Id-1及ERK1/2 mRNA在空白對照組及陰性對照組的裸鼠皮下腫瘤組織中均存在表達，在轉(zhuǎn)染實驗組則受到有效抑制(P<0.05,圖4，表4)。

2.5Western-blot檢測各組腫瘤組織中Id-1,ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達 Id-1,ERK1/2及p-ERK1/2蛋白在空白對照組及陰性對照組的裸鼠皮下腫瘤組織中均存在表達，且表達相似，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而轉(zhuǎn)染實驗組的裸鼠皮下腫瘤中，Id-1及p-ERK1/2蛋白水平均被有效抑制，與空白對照組及陰性對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但ERK1/2蛋白的表達變化不明顯(圖5)。

1：空白對照組； 2：陰性對照組； 3：轉(zhuǎn)染實驗組. A：Id-1；B：ERK1/2.圖4 RT-PCR法檢測siRNA對各組裸鼠皮下腫瘤中Id-1及ERK1/2 mRNA表達的影響Fig 4 The effect of siRNA on the expression of Id-1 and ERK1/2 mRNA in subcutaneous tumors in nude mice

分 組Id-1/actin(ERK1/2)/actin空白對照組0.845±0.1130.977±0.082陰性對照組0.917±0.0830.978±0.056轉(zhuǎn)染實驗組0.389±0.058☆△0.475±0.079☆△

與空白對照組比較，☆：P<0.01；與陰性對照組比較，△：P<0.01.

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：轉(zhuǎn)染實驗組.圖5 Western-blot檢測RNA干擾前后各組腫瘤組織中Id-1,ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表達Fig 5 Effect of siRNA on the protein level of Id-1, ERK1/2 and p-ERK1/2 in subcutaneous tumor of nude mice by Western-blot

3 討 論

RNAi技術(shù)是一種在轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因表達的、研究基因功能的強有力工具，具有高特異性、高效率性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點；siRNA是RNA干擾中重要的效應(yīng)分子[4]。應(yīng)用微量siRNA即可使編碼基因產(chǎn)物表達量下降90%以上，甚至達到完全敲除[5]。多種腫瘤細胞系的實驗也證實，RNAi現(xiàn)象存在于腫瘤細胞中[6]。基因轉(zhuǎn)移方法可分為非病毒學和病毒學2種，因前者轉(zhuǎn)移效率較低，所以絕大多數(shù)人體試驗的基因治療方案采用后者進行。經(jīng)過改構(gòu)的慢病毒具有感染分裂期和非分裂細胞的能力，可以有效地轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，并能夠整合于宿主細胞的基因組，而實現(xiàn)靶基因的穩(wěn)定沉默，已成為當前基因治療中載體研究的熱點。基因治療的關(guān)鍵問題之一是如何將目的基因?qū)氚屑毎?，并得到穩(wěn)定、高效表達。目前，在長期維持基因敲減效率的載體中，慢病毒載體系統(tǒng)可能是攜帶siRNA的理想載體之一。因此，本研究選擇了慢病毒表達載體介導siRNA特異地抑制Id-1基因的表達，為深入開展研究Id-1的基因功能奠定基礎(chǔ)。本研究成功構(gòu)建Id-1-RNAi-Lentivirus，可有效感染肝癌HepG2細胞，經(jīng)半定量RT-PCR篩選出干擾效率最佳的靶序列sh31，表明通過構(gòu)建攜帶Id-1基因特異性siRNA的慢病毒表達載體，并轉(zhuǎn)染、篩選穩(wěn)定沉默Id-1基因表達的肝癌HepG2細胞系的方法是可行和有效的，為深入開展研究Id-1對HCC發(fā)生發(fā)展的影響及可能的分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

Id-1可以促進細胞的增殖及細胞周期的進展，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實，Id-1與HBV感染相關(guān)性HCC密切相關(guān)[7]。體內(nèi)研究的初步結(jié)果表明，Id-1-RNAi-Lentivirus組的裸鼠腫瘤生長緩慢，瘤體質(zhì)量明顯低于空白及陰性對照組。常規(guī)H-E染色也顯示，移植瘤組織壞死增多，細胞凋亡增多，增殖緩慢,提示穩(wěn)定沉默Id-1表達后，能有效抑制裸鼠皮下移植瘤的增長，證明Id-1在促進肝癌腫瘤細胞的增殖、抑制細胞的凋亡中發(fā)揮重要的作用。

既往研究證明，ERK1/2也在肝癌組織中高表達，ERK1/2表達與HCC細胞中細胞增殖抗原標記指數(shù)呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，提示ERK1/2的過表達有助于HCC細胞的生長和增殖[8]。ERK也成為肝癌治療的重要分子靶點之一。

本實驗中，Id-1及ERK1/2 mRNA在肝癌組織中均存在高表達，而通過siRNA穩(wěn)定沉默Id-1基因表達后，ERK1/2在mRNA水平被有效抑制。進一步行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著Id-1蛋白表達下調(diào)，ERK1/2蛋白的磷酸化活性形式p-ERK1/2蛋白的表達亦降低(P<0.05)，但總的ERK1/2蛋白表達變化不大，結(jié)合裸鼠荷瘤大小隨著Id-1的沉默而受到明顯的抑制，提示Id-1可能是通過激活ERK1/2信號通路促進HepG2細胞的增殖。這一結(jié)果與本課題組在前期采用化學合成、針對Id-1特異的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞系及食管鱗癌TE-1細胞系、沉默Id-1的結(jié)果相一致[2-3]。由此推測，Id-1和ERK1/2在促進肝癌增殖、抑制凋亡中有著密切的關(guān)系，Id-1可能通過激活ERK1/2信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是Id-1如何直接或間接激活調(diào)控ERK1/2的信號轉(zhuǎn)導通路，以及其與ERK1/2上下游信號分子存在什么關(guān)系，有待進一步深入研究。