朱慧敏，李 莉

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830000)

新疆黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)是小檗科(Berberisheteropoda)小檗屬(Berberisheteropoda.L.)灌木植物[1-2]，又名刺黃連、刺黃柏和則熱克(維吾爾藥名)。小檗根氣微，味苦，小檗根皮性涼，有清熱瀉火的作用[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黑果小檗主要含有生物堿[5-6]、黃酮[7]、色素[8]、花色苷[9-10]和脂肪酸等[11]物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑果小檗具有抗菌[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化[14]、誘變[15]和抗肝損傷[16]等廣泛的藥理作用。資源分布廣泛，開發(fā)潛力很大[17]。在民間，本屬植物根皮常代替黃柏、黃連藥用。維吾爾醫(yī)、哈薩克醫(yī)常用其治療胃腸炎、痢疾、痔瘡、急性結(jié)膜炎和泌尿系統(tǒng)感染等，具有抗菌消炎的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，新疆黑果小檗中的小檗堿和小檗胺對金黃色葡萄球菌等腸道致病菌具有抑制作用。因此，本實驗結(jié)合牛津杯法與倍比稀釋法[20-21]對新疆黑果小檗對腸道致病菌的抑菌作用進(jìn)行研究，為藥用植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 ES-315高壓滅菌鍋(日本TOM Y Seiko有限公司)；HH-S4恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)(上海一恒科技有限公司)；TS-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海天呈實驗儀器制造有限公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；TB-114電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；內(nèi)徑Φ6.0 mm×10.0 mm牛津杯(上海儀翀科技發(fā)展有限公司)。

1.2試藥 新疆黑果小檗根于2015年9月采自烏魯木齊市東白楊溝，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布利孜教授鑒定為小檗科小檗屬植物黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)的根。室溫陰干，粉碎，備用。阿莫西林膠囊(中諾藥業(yè)有限公司，批號06107627)；金黃色葡萄球菌(批號CMCC 16412)、大腸桿菌(批號CMCC 44102)、銅綠假單胞菌(批號MCCCB 10104)和糞腸球菌(批號ATCC 2912)，均由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗所提供。

1.3材料 M-H瓊脂培養(yǎng)基(批號20160217)，M-H肉湯培養(yǎng)基(批號20161107)，青海高科園海博生物技術(shù)有限公司；注射用生理鹽水(國藥集團(tuán)新疆制藥有限公司，批號150303)；水為自制蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1樣品溶液的制備 分別稱取50 g黑果小檗根皮、根木質(zhì)部，置于1 000 mL圓底燒瓶中，分別加入10倍量甲醇溶液，70 ℃回流提取2次，每次提取2 h，取出，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，合并濾液，60 ℃減壓回收甲醇，得甲醇提取物浸膏。將所得甲醇提取物浸膏置于100 mL量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度。分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮依次萃取，得不同溶劑萃取液，揮干溶劑，得不同溶劑萃取物浸膏，稱定質(zhì)量。精密稱取一定量不同溶劑萃取物浸膏，分別置于5 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得一定質(zhì)量濃度的樣品溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱中冷藏，備用。見表1。

表1各樣品稱樣量及質(zhì)量濃度

Tab.1 Samples weight and concentration

提取部位有效部位名稱稱樣量/mg質(zhì)量濃度/mg·mL-1回流法提取根皮石油醚部位(A)112.25022.450二氯甲烷部位(B)144.87528.975乙酸乙酯部位(C)320.25064.050正丁醇部位(D)350.00070.000丙酮部位(E)262.00052.400 回流法提取根木質(zhì)部石油醚部位(K)339.62567.925二氯甲烷部位(L)137.87527.575乙酸乙酯部位(M)55.75011.150正丁醇部位(N)142.37528.475丙酮部位(O)303.75060.750

2.1.2抗菌藥物儲存液的制備 精密稱取阿莫西林10.8 mg，置于5 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為2.16 mg·mL-1的對照品溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，將配制好的抗菌藥物貯存液貯存于4 ℃冰箱中，備用。

2.1.3培養(yǎng)基的制備 使用NCCLS推薦使用Mueller-hinton(M-H)瓊脂培養(yǎng)基以及Mueller-hinton(M-H)肉湯培養(yǎng)基，pH值為7.2～7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。

2.1.3.1M-H瓊脂培養(yǎng)基的配制 將41.2 g M-H瓊脂培養(yǎng)基，緩慢攪拌加入盛有1 000 mL熱水的具塞錐形瓶中，待培養(yǎng)基全部融化，封住瓶口，置于121 ℃滅菌鍋中濕熱滅菌30 min。

2.1.3.2M-H肉湯培養(yǎng)基的配制 將21.0 g M-H肉湯培養(yǎng)基，緩慢攪拌加入盛有1 000 mL熱水的具塞錐形瓶中，待培養(yǎng)基全部融化，封住瓶口，置于121 ℃滅菌鍋中濕熱滅菌30 min。

2.1.4細(xì)菌生長法制備菌懸液 分別將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌的凍存菌室溫融化后，在超凈工作臺中，用經(jīng)高壓濕熱滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方法將細(xì)菌涂布于M-H平面培養(yǎng)基上，置于35～37 ℃、5%～10% CO2的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)分別挑取上述4種菌的單個菌落，接種于M-H液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24 h，用注射用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度(1×108cfu·mL-1)，備用。

2.1.5抑菌活性研究

2.1.5.1平板制備 將直徑90 mm、高16～17 mm的平底雙碟置于超凈工作臺上，用經(jīng)高壓濕熱滅菌的棉簽蘸取一定量2.1.4項下制備的0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)菌懸液均勻涂抹于碟底，注入融化狀態(tài)的2.1.3.1項下制備的M-H瓊脂培養(yǎng)基4 mm，使其在碟底均勻攤布，待其凝固，作為底層。另取2.1.3.1項下的M-H瓊脂培養(yǎng)基10 mL，放冷至48～50 ℃，加入2.1.4項下制備的菌懸液100 μL，搖勻，在底層均勻攤布，作為菌層。

2.1.5.2牛津杯法測定抑菌活性 待2.1.5.1項下制備的的平板冷卻后，在各平板中以等距離均勻放置已滅菌的牛津杯3個，分別加入100 μL的供試品溶液和抗菌藥物貯存液，同時以相同體積的蒸餾水作為空白對照，將平板置于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈大小，平行3次實驗。

2.1.5.3常量肉湯稀釋法的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)測定 取無菌試管(13 mm×100 mm)13支，排成一排，每管加入2.1.3.2項下制備的M-H肉湯培養(yǎng)基1 mL以及2.1.4項下制備的菌懸液20 μL，在第1管中加入供試品原液1 mL，混勻，吸取1 mL加入第2管，混勻，再吸取1 mL加入第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1 mL棄去，第12管為不含供試品的生長對照，第13管為加等體積蒸餾水的生長對照。將接種好的稀釋管密塞，置于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24 h，觀察各試管的澄清度。若試管顯示澄清，說明試藥對實驗菌有抑菌作用；若試管顯示渾濁，則說明試藥對實驗菌無抑菌作用。澄清試管的最低質(zhì)量濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度。

2.2結(jié)果

2.2.1抑菌活性 用毫米尺測量抑菌圈的大小。若試藥對實驗菌有抑菌活性，則牛津杯/藥敏片周圍的培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見的透明圈，反之則無。抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小；若無抑菌圈，說明此藥對該菌無抑菌效果。結(jié)果見表2。

表2牛津杯法測定黑果小檗根皮、根木質(zhì)部不同萃取部位浸膏的抑菌活性結(jié)果

藥材來源萃取部位牛津杯法抑菌圈直徑/mm 大腸桿菌銅綠假單胞菌 糞腸球菌金黃色葡萄球菌根皮石油醚部位(A)- - - 10.20±0.88*##二氯甲烷部位(B) 8.25±1.03*## 7.50±0.84 8.55±0.92*23.50±0.46**##乙酸乙酯部位(C)- - - - 正丁醇部位(D)12.15±0.98*## 8.25±0.29* 9.42±0.64*26.35±0.32**##丙酮部位(E)14.11±1.21*#11.50±1.42*10.15±0.85*22.45±1.54**##根木質(zhì)部石油醚部位(K)- - - 15.50±0.35*##二氯甲烷部位(L) 6.43±0.84- 8.42±0.95*17.38±0.39*##乙酸乙酯部位(M)- - - - 正丁醇部位(N) 8.55±0.38*## 6.10±0.15- 26.46±1.42**##丙酮部位(O) 8.28±0.24*##- 6.50±1.2218.46±0.95*##阿莫西林28.50±1.28** 8.15±0.42 8.15±1.03*50.25±1.10**水-## -# -# -## P根皮-根木質(zhì)部 >0.05 <0.05 <0.05 >0.05

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與阿莫西林比較#P<0.05，##P<0.01。-表示無抑菌作用。

由表2可知，供試品對大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：阿莫西林>E>D>N>B=O>L；對銅綠假單胞菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：E>D>B>阿莫西林>N；對糞腸球菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：E>D>B>L>阿莫西林>O；對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：阿莫西林>D=N>B>E>O>L>K>A。

與空白組比較，提取物B、D和E對大腸桿菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，阿莫西林對大腸桿菌的抑制作用顯著高于空白組(P<0.01)，提取物D、E和阿莫西林對銅綠假單胞菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，提取物B、D、E、L和阿莫西林對糞腸球菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，提取物A、K、L和O對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，提取物B、D、E、N和阿莫西林對金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高于空白組(P<0.05)。

通過兩樣本獨立t檢驗對比根皮、根木質(zhì)部的抑菌活性可知，對于4種腸道致病菌而言，根皮與根木質(zhì)部的抑菌活性相當(dāng)(P>0.05)。

綜上所述，培養(yǎng)24 h后，黑果小檗萃取物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別在6.43～14.11，6.10～11.50，6.50～10.15和10.20～26.46 mm范圍內(nèi)。

2.2.2最小抑菌質(zhì)量濃度測定結(jié)果 在2.2.1實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，研究浸膏A、B、D、E、K、L、N和O的MIC。結(jié)果見表3。

由表3可知，浸膏A對金黃色葡萄球菌的MIC為5.613 mg·mL-1；浸膏B對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.811，7.244，14.488和0.453 mg·mL-1；浸膏D對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為4.375，17.50，8.75和0.547 mg·mL-1；浸膏E對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為3.275，13.1，13.1和0.409 mg·mL-1；浸膏K對金黃色葡萄球菌的MIC為1.061 mg·mL-1；浸膏L對大腸桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為6.894，13.788和1.723 mg·mL-1；浸膏N對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.119，14.238和0.445 mg·mL-1；浸膏O對大腸桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為15.188，30.375和1.898 mg·mL-1。

表3浸膏對4種致病菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測定結(jié)果

Tab.3 The determination results of minimum inhibitory concentration (MIC) of the extracts on 4 kinds of test bacteria(mg·mL-1)

萃取部位大腸桿菌糞腸球菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌A- - - 5.613B1.8117.24414.4880.453D4.37517.5008.7500.547E3.27513.10013.1000.409K- - - 1.061L6.89413.788- 1.723N7.119- 14.2380.445O15.18830.375- 1.898

注：-表示無抑菌作用。

綜上所述，浸膏A、B、D、E、K、L、N和O對4種致病菌均有不同程度的抑制作用，培養(yǎng)24 h后，黑果小檗萃取物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1.811～15.188，8.750～14.488，7.244～30.375和0.409～5.613 mg·mL-1。

3 討論

由實驗結(jié)果可知，新疆黑果小檗根部對4種致病菌均有不同程度的抑制作用，本實驗通過不同溶劑萃取根皮與根木質(zhì)部甲醇提取物水溶液中所得不同有效部位進(jìn)行抗菌實驗，同時對比根皮與根木質(zhì)部對抑菌效果的影響，結(jié)果表明，根皮與根木質(zhì)部對4種致病菌的抑菌效果無差別(P>0.05)，根皮與根木質(zhì)部抑菌活性相當(dāng)。維吾爾醫(yī)常以根皮入藥，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，黑果小檗根木質(zhì)部也具有一定的抑菌活性，其中根皮與根木質(zhì)部對于金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，對銅綠假單胞菌具有抑菌作用的部位較少，由此可見，黑果小檗根部不同有效部位對不同腸道致病菌的抑菌效果不一，根木質(zhì)部也可作為用藥部位，且具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。

黑果小檗是我國較為重要的藥用植物資源之一，目前對黑果小檗的研究主要集中于種類差異、成分分析等，針對黑果小檗抑菌作用的研究較少。本文采用牛津杯法和試管倍比稀釋法對新疆黑果小檗根皮及根木質(zhì)部的體外抑菌活性做了較全面的探究。實驗結(jié)果表明，黑果小檗根皮及根木質(zhì)部萃取液對腸道革蘭氏陰性菌以及革蘭氏陽性菌等致病菌均有一定的抑制作用。本文驗證了黑果小檗根皮及根木質(zhì)部確切有效的抑菌活性，對于開發(fā)廣譜新型中藥抗菌藥物具有一定的指導(dǎo)意義，為黑果小檗用藥部位的選擇及研究黑果小檗治療由菌群紊亂引起的腸道疾病奠定基礎(chǔ)。