廖小紅，唐洪梅，丘振文，何嘉侖，李得堂

(廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

腸激安制劑是在我院使用多年的臨床經(jīng)驗方基礎(chǔ)上開發(fā)的治療腹瀉型腸易激綜合征的醫(yī)院制劑[1-2]。處方由白芍、枳殼、石榴皮、延胡索、黃連和陳皮等組成，具有疏肝健脾、清熱利濕和止痛止瀉的功效，主治腹瀉型腸易激綜合征、腹痛腹瀉和腸功能紊亂等，療效確切，但該制劑的質(zhì)量標準研究未見報道[3]。腹瀉型腸易激綜合征是一種常見的慢性非器質(zhì)性腸功能紊亂性疾病[4-6]，臨床癥狀表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛腹瀉，病程長[7]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。腸激安制劑從肝脾論治，治療肝郁脾虛型腹瀉型腸易激綜合征效果明顯，機制研究表明，其能通過調(diào)節(jié)腦-腸軸異常改善腹瀉型腸易激綜合征大鼠的癥狀，但目前尚無腸激安制劑的長期毒性研究報道，因此，為了進一步研究腸激安制劑長期用藥的安全性，為腸激安制劑的臨床安全用藥及新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)，根據(jù)《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]，本文進行了腸激安制劑對大鼠的長期毒性研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 950FS全自動動物血液分析儀(美國HEMAVET公司)；日立7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)；H-300尿液分析儀(長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司)。

1.2試藥 腸激安制劑(批號100403，廣東省中醫(yī)研究所工藝研究室)；鈣、磷、總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)苷酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、三酰甘油和總膽固醇測試盒(批號：20081116，20090511，20090711，20090614，20090615，20090713，20090616，20090714，購自北京利德曼公司)；葡萄糖測試盒(批號20090510，中生北控生物科技股份有限公司)；肌酐、尿素氮測試盒(批號：20090406，20090614，煙臺奧斯邦生物工程有限公司)；總蛋白、白蛋白和球蛋白測試盒(批號：20090410，20090515，20090509，上?？迫A東菱診斷用品有限公司)。

1.3實驗動物 SPF級SD大鼠，80只，6～7周齡，雌雄各半(實驗設(shè)施許可證號：SCXK(粵)2008-0002，實驗動物合格證號：N00070059)，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1分組與給藥途徑 6～7周齡SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，按照體質(zhì)量隨機分為對照組和腸激安制劑高、中、低劑量組，實驗采用灌胃給藥，給藥途徑與臨床用藥一致，各給藥組按照劑量灌胃給藥，給藥體積為20 mL·kg-1，對照組同法灌胃給予蒸餾水20 mL·kg-1。

2.2劑量設(shè)置 腸激安制劑臨床擬用量為每日0.264 g，本實驗根據(jù)腸激安制劑的特點，設(shè)置高、中、低劑量，分別為15.624，7.812和3.906 g·kg-1，相當于擬用臨床劑量的60，30和15倍。

2.3給藥方法及檢測指標 每日上午9時灌胃給予藥物，20 mL·kg-1·d-1。每日1次，連續(xù)給藥6周，每周測定1次體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，恢復(fù)觀察期為停藥后2周。每周測量其體質(zhì)量和進食量，于給藥6周后、停藥2周后每組隨機處死10只大鼠，雌雄各半，動物處死前禁食12 h，收集尿液、全血、血清和主要臟器進行尿常規(guī)、血常規(guī)、血生化和病理組織學檢查。尿常規(guī)：測定尿液中葡萄糖、膽紅素、酮體、尿比重、酸堿度、尿蛋白、尿膽原、亞硝酸鹽、潛血和白細胞等；血常規(guī)：測定大鼠紅細胞、全血白細胞、嗜中性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿細胞數(shù)量以及嗜中性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿細胞比率；血生化：檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、白球比、總膽紅素、直接膽紅素、堿性磷酸酶、葡萄糖、尿素和肌酐；對動物進行尸檢，取動物重要臟器：心、肝、脾、肺等稱定質(zhì)量，計算臟器系數(shù)，進行病理組織學檢查。數(shù)據(jù)處理由SPSS 15.0統(tǒng)計軟件完成。

3 結(jié)果

3.1一般狀態(tài)觀察 整個實驗過程中以及停藥恢復(fù)期2周內(nèi)，各組大鼠動物采食、毛色、活動、大鼠呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形狀和顏色等均正常，大鼠無死亡。

3.2對大鼠體質(zhì)量的影響 見表1。由表1可知，在給藥前、給藥期間以及停藥恢復(fù)觀察期內(nèi)，腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量、進食量與對照組大鼠相比基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1腸激安制劑對大鼠體質(zhì)量的影響

測定時間/周性別對照組/g腸激安方高劑量組/g腸激安方中劑量組/g腸激安方低劑量組/g 0雄性93.76±5.4693.69±6.69*94.06±6.86* 93.68±8.55*雌性88.21±6.4288.33±6.04#88.27±6.64# 88.29±2.97#1雄性155.21±12.09154.86±10.43*155.25±11.10*150.43±14.71*雌性141.75±9.08142.22±10.84#142.02±8.73#136.57±5.50#2雄性178.50±15.24174.63±10.53*191.24±10.92*179.93±15.56*雌性159.76±12.65163.60±22.23#165.62±17.26#164.09±9.88#3雄性247.52±18.77256.66±13.80*264.38±22.92*269.62±23.31*雌性201.51±10.70206.65±14.99#201.07±16.66#202.04±6.71#4雄性300.51±18.97297.20±14.40*306.73±12.65*312.72±29.12*雌性215.51±15.64224.62±18.95#219.81±23.55#218.14±10.48#5雄性352.83±25.72339.70±18.09*357.58±14.36*357.26±31.78*雌性233.32±19.41233.55±20.64#237.35±26.89#233.68±10.73#6雄性381.03±33.30371.32±19.31*395.92±20.67*394.86±33.64*雌性246.51±21.02248.49±22.23#257.37±28.78#246.86±12.30#7雄性396.10±33.20387.24±20.98*403.45±46.51*408.63±34.72*雌性259.25±23.14258.68±22.04#261.46±31.15#252.65±13.31#8雄性426.46±26.71401.14±39.58*426.80±25.35*418.00±35.24*雌性252.18±18.78269.64±35.38#262.16±26.98#253.58±10.61#9雄性459.96±31.42434.44±41.89*460.06±30.31*448.56±38.78*雌性268.50±14.43287.78±27.56#271.34±21.33#266.36±7.60#

注：雄性大鼠與對照組比較*P>0.05；雌性大鼠與對照組比較#P>0.05。

3.3對大鼠尿常規(guī)指標的影響 見表2。由表2可知，與對照組比較，腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠在給藥6周后、停藥恢復(fù)觀察2周后尿液中葡萄糖、膽紅素、酮體、尿比重、酸堿度、尿蛋白、尿膽原、亞硝酸鹽、潛血和白細胞等各項檢測指標含量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2腸激安制劑對大鼠尿常規(guī)指標的影響

測定項目測定時間對照組腸激安方高劑量組腸激安方中劑量組腸激安方低劑量組尿比重 給藥6周停藥2周1.008±0.0031.011±0.0041.007±0.003*1.009±0.003#1.007±0.003*1.011±0.004#1.007±0.002*1.010±0.004#酸堿度 給藥6周停藥2周6.900±0.2116.950±0.3696.700±0.258*6.800±0.587#6.850±0.242*6.800±0.350#6.850±0.242*6.800±0.350#尿亞硝酸鹽 給藥6周停藥2周0.200±0.4221.000±0.0000.200±0.422*1.000±0.000#0.200±0.422*1.000±0.000#0.400±0.516*1.000±0.000#葡萄糖/mmol·L-1 給藥6周停藥2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿膽紅素/μmol·L-1 給藥6周停藥2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿酮體/mmol·L-1 給藥6周停藥2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿蛋白/g·L-1 給藥6周停藥2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿膽原/μmol·L-1 給藥6周停藥2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#

注：給藥6周后與對照組比較*P>0.05；停藥2周后與對照組比較#P>0.05。

3.4對大鼠血常規(guī)指標的影響 見表3。由表3可知，給藥6周后及停藥恢復(fù)2周后腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠血液中各項檢測指標數(shù)值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3腸激安制劑對大鼠血常規(guī)指標的影響

測定指標測定時間對照組腸激安方高劑量組腸激安方中劑量組腸激安方低劑量組白細胞(×109·L-1) 給藥6周停藥2周10.86±0.2811.10±0.7410.74±0.22*11.37±0.54#10.79±0.33*11.15±0.54#11.05±0.34*11.03±0.25#中性粒細胞(×109·L-1)給藥6周停藥2周 3.81±0.16 3.87±0.50 3.55±0.16* 3.95±0.40# 3.66±0.18* 3.97±0.15# 3.81±0.19* 3.73±0.18#淋巴細胞(×109·L-1)給藥6周停藥2周 5.11±0.30 5.08±0.23 5.05±0.13* 4.98±0.39# 4.90±0.21* 4.98±0.36# 4.84±0.23* 5.04±0.22#嗜酸性粒細胞(×109·L-1)給藥6周停藥2周 1.02±0.11 1.05±0.21 1.02±0.11* 1.07±0.19# 1.03±0.12* 1.09±0.14# 1.10±0.14* 1.06±0.14#嗜堿性粒細胞(×109·L-1)給藥6周停藥2周 0.53±0.07 0.56±0.16 0.54±0.06* 0.64±0.19# 0.58±0.09* 0.60±0.09# 0.59±0.11* 0.57±0.10#中性粒細胞百分比%給藥6周停藥2周33.21±0.9833.89±1.8933.04±0.89*34.63±2.11#33.85±0.95*34.32±1.26#33.45±1.74*33.82±0.96#淋巴細胞百分比/%給藥6周停藥2周47.03±2.4745.98±3.7947.11±1.78*43.99±4.92#45.42±2.15*48.30±11.08#44.96±2.63*45.70±2.60#單核細胞百分比/%給藥6周停藥2周 6.00±0.31 5.73±0.34 5.70±0.29* 5.72±0.35# 5.72±0.33* 5.78±0.27# 5.82±0.24* 5.78±0.26#嗜酸性粒細胞百分比/%給藥6周停藥2周 9.12±0.87 9.40±1.24 9.18±0.62*10.07±1.67# 9.70±0.79* 9.83±1.05# 9.43±0.95* 9.54±1.10#

注：給藥6周后與對照組比較*P>0.05；停藥2周后與對照組比較#P>0.05。

3.5對大鼠血液生化指標的影響 見表4。由表4可知，與對照組比較，給藥6周后及停藥恢復(fù)2周后腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠血清中各指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4腸激安制劑對大鼠血生化指標的影響

項目測定時間對照組腸激安制劑高劑量組腸激安制劑中劑量組腸激安制劑低劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/U·L-1給藥6周28.60±3.5028.50±8.29*30.70±4.14*28.10±3.78*停藥2周29.20±5.5729.10±6.42#28.90±6.84#30.30±5.14#天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/U·L-1給藥6周138.20±30.06137.90±39.18*133.10±11.36*128.30±9.67*停藥2周123.30±19.32115.10±11.69#131.40±23.70#130.00±22.39#總蛋白/g·L-1給藥6周71.79±3.0174.47±4.82*73.30±2.16*71.76±2.79*停藥2周73.43±5.0273.14±4.69#75.75±4.45#75.24±4.90#白蛋白/g·L-1給藥6周36.09±1.8437.09±2.45*37.17±2.21*36.51±1.60*停藥2周36.47±2.4336.44±3.03#37.54±2.49#37.67±2.83#球蛋白/g·L-1給藥6周35.70±2.3237.38±3.28*36.13±2.23*35.25±1.64*停藥2周36.96±2.8536.70±2.70#38.22±2.79#37.57±2.23#陰離子間隙給藥6周1.01±0.081.00±0.09*1.03±0.11*1.04±0.05*停藥2周0.99±0.051.00±0.09#0.99±0.07#1.00±0.04#總膽紅素/μmol·L-1給藥6周0.68±0.260.62±0.27*0.68±0.26*0.83±0.22*停藥2周0.98±0.181.02±0.33#0.99±0.21#0.97±0.32#直接膽紅素/μmol·L-1給藥6周0.36±0.160.34±0.15*0.31±0.11*0.36±0.12*停藥2周0.44±0.080.51±0.19#0.46±0.13#0.45±0.16#堿性磷酸酶/U·L-1給藥6周184.30±36.94188.50±56.72*161.10±37.10*186.00±46.47*停藥2周155.50±50.93152.80±60.64#163.60±39.06#154.90±49.57#葡萄糖/mmol·L-1給藥6周5.23±0.456.17±1.45*5.30±0.43*5.44±0.85*停藥2周5.65±0.546.19±0.44#5.67±0.71#6.17±0.64#尿素/mmol·L-1給藥6周5.96±0.705.42±0.79*5.79±0.33*6.12±0.95*停藥2周6.01±0.655.80±0.53#6.00±0.68#6.21±1.03#肌酐/μmol·L-1給藥6周59.28±16.3948.69±16.28*50.30±10.32*53.41±14.86*停藥2周54.77±7.3552.49±10.70#50.65±8.14#47.89±14.03#鈣/mmol·L-1給藥6周2.60±0.112.71±0.12*2.78±0.36*2.61±0.10*停藥2周2.80±0.262.76±0.16#2.84±0.30#2.75±0.15#磷/mmol·L-1給藥6周2.58±0.272.62±0.44*2.70±0.37*2.70±0.56*停藥2周2.43±0.402.40±0.40#2.46±0.37#2.46±0.37#鎂/mmol·L-1給藥6周0.99±0.041.03±0.11*1.03±0.07*1.03±0.11*停藥2周1.04±0.051.00±0.06#1.08±0.11#1.07±0.09#總膽固醇/mmol·L-1給藥6周1.98±0.282.04±0.41*1.88±0.31*1.87±0.24*停藥2周2.09±0.261.93±0.20#1.94±0.27#2.05±0.24#甘油三酯/mmol·L-1給藥6周1.07±0.290.87±0.28*1.00±0.39*1.01±0.45*停藥2周1.26±0.501.22±0.46#0.98±0.29#1.09±0.29#

注：給藥6周后與對照組比較*P>0.05；停藥2周后與對照組比較#P>0.05。

3.6對大鼠臟器指數(shù)的影響 見表5。由表5可知，與對照組比較，腸激安制劑給藥6周后和停藥2周后腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠主要臟器指數(shù)如心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、胸腺、睪丸(雄)、附睪(雄)、卵巢(雌)、子宮(雌)、甲狀腺和前列腺(雄)指數(shù)等與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5腸激安制劑對大鼠臟器指數(shù)的影響

項目測定時間對照組腸激安制劑高劑量組腸激安制劑中劑量組腸激安制劑低劑量組心給藥6周0.267±0.0130.271±0.024*0.279±0.043*0.284±0.026*停藥2周0.293±0.0250.309±0.052#0.289±0.027#0.305±0.029#肝給藥6周2.660±0.1902.550±0.167*2.474±0.121*2.533±0.131*停藥2周2.642±0.2262.533±0.167#2.520±0.187#2.625±0.242#脾給藥6周0.206±0.0240.195±0.033*0.193±0.021*0.197±0.021*停藥2周0.178±0.0310.198±0.022#0.183±0.036#0.183±0.031#肺給藥6周0.534±0.1410.501±0.106*0.522±0.138*0.544±0.148*停藥2周0.452±0.0580.448±0.052#0.471±0.077#0.466±0.080#腎給藥6周0.641±0.0610.647±0.037*0.627±0.039*0.631±0.032*停藥2周0.606±0.0340.627±0.034#0.599±0.044#0.673±0.190#腦給藥6周0.586±0.0970.556±0.105*0.571±0.118*0.580±0.130*停藥2周0.522±0.1730.546±0.117#0.533±0.149#0.541±0.130#腎上腺給藥6周0.018±0.0050.019±0.005*0.022±0.005*0.023±0.008*停藥2周0.025±0.0090.020±0.006#0.021±0.007#0.019±0.007#胸腺給藥6周0.156±0.0470.139±0.040*0.147±0.044*0.141±0.038*停藥2周0.128±0.0360.139±0.064#0.100±0.025#0.105±0.021#睪丸(雄)給藥6周0.865±0.2360.862±0.063*0.888±0.085*0.814±0.066*停藥2周0.792±0.0550.797±0.096#0.761±0.042#0.750±0.079#附睪(雄)給藥6周0.307±0.0440.301±0.042*0.307±0.047*0.283±0.031*停藥2周0.331±0.0840.349±0.056#0.297±0.058#0.294±0.030#卵巢(雌)給藥6周0.053±0.0090.056±0.012*0.051±0.011*0.058±0.013*停藥2周0.068±0.0170.054±0.013#0.062±0.024#0.054±0.005#子宮(雌)給藥6周0.290±0.0840.273±0.081*0.249±0.093*0.240±0.066*停藥2周0.253±0.1070.239±0.077#0.244±0.070#0.322±0.172#甲狀腺給藥6周0.011±0.0030.012±0.004*0.010±0.004*0.011±0.002*停藥2周0.009±0.0020.010±0.003#0.008±0.002#0.008±0.003#前列腺(雄)給藥6周0.143±0.0320.142±0.019*0.147±0.021*0.156±0.026*停藥2周0.151±0.0420.146±0.030#0.107±0.043#0.127±0.013#

注：給藥6周后與對照組比較*P>0.05；停藥2周后與對照組比較#P>0.05。

3.7病理學檢查 給藥6周后和停藥恢復(fù)2周后腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠(n=10)組織病理學檢查鏡下觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺和胸腺等主要臟器與對照組基本相同，未見明顯異常病理改變。見圖1。

圖1病理學檢查結(jié)果

A.給藥后6周;B.停藥后2周;a.對照組；b.腸激安制劑高劑量組；c.腸激安制劑中劑量組；d.腸激安制劑低劑量組。

Fig.1 Results of pathological examination

A.6 weeks after administration；B.2 weeks after stopping use of the medicine；a.control group；b.high dose group of Changji′an Preparation；c.middle dose group of Changji′an Preparation；d.low dose group of Changji′an Preparation.

4 討論

腸激安制劑是在我院使用多年的臨床經(jīng)驗方基礎(chǔ)上開發(fā)的治療腹瀉型腸易激綜合征的醫(yī)院制劑，本課題組對其工藝、質(zhì)量標準、動物模型、藥效學、毒理學及干預(yù)腹瀉型腸易激綜合征的機制等都有了成熟的研究[9-14]。腸激安制劑由白芍、柴胡、甘草、延胡索、黃連和陳皮等組成，有文獻報道，白芍總苷在治療干燥綜合征27例中有1例出現(xiàn)嚴重腹瀉，4例出現(xiàn)輕度腹瀉[15]；黃連及其制品黃連素等有時會發(fā)生藥物不良反應(yīng)如藥疹、變態(tài)反應(yīng)以及血細胞減少等[16]；孫蓉等[17]發(fā)現(xiàn)，不同基源、炮制和提取方法的柴胡樣品中柴胡總皂苷、柴胡皂苷a含量與急性毒性大小呈正相關(guān)，柴胡總皂苷小鼠口服 LD50為4.5 g·kg-1，大鼠給予柴胡30 d可致肝功能異常[18]。孫蓉等[19]研究證實,長時間、大劑量使用柴胡水煎劑可造成大鼠明顯的肝毒性損傷，與臨床報道一致。中藥不是完全無毒的，其具有一定的偏性，因此對腸激安制劑的長期毒性研究具有重大意義。

研究結(jié)果表明，大鼠灌胃給予腸激安制劑高劑量15.624 g·kg-1·d-1(臨床成人擬用劑量60倍)、腸激安制劑中劑量7.812 g·kg-1·d-1(臨床成人擬用劑量30倍)和腸激安制劑低劑量3.906 g·kg-1·d-1(臨床成人擬用劑量15倍)，每日1次，連續(xù)給藥6周后與對照組比較，各項檢測指標如一般狀態(tài)、體質(zhì)量、尿液、血液學、血液生化學、臟器系數(shù)和組織病理學等，未見明顯的毒性敏感指標和毒性靶器官；停藥恢復(fù)2周后腸激安制劑高、中、低劑量組大鼠各項檢測指標均正常，未見腸激安制劑產(chǎn)生遲發(fā)性毒性反應(yīng)和蓄積性毒性反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，長期應(yīng)用腸激安制劑對大鼠無明顯毒性和不良反應(yīng)，臨床成人擬用劑量和療程均處于安全范圍。

綜上所述，腸激安制劑高劑量(15.624 g·kg-1)為臨床人用劑量60倍時，大鼠長期灌喂給藥，未見明顯毒性反應(yīng)，表明腸激安方毒性小，按照臨床擬用劑量服用是安全的。