黃 靜，李 昂，劉宇光，張執(zhí)剛，白忠秀，杜大軍，王淑敏

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.沛芝堂(遼寧)科技發(fā)展有限公司，沈陽(yáng) 110001)

痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄減少而致血尿酸水平升高，尿酸鹽晶體沉積于組織或器官并引起組織損傷的一組臨床綜合征，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛與功能障礙，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、腎石病及尿酸性腎病等。目前臨床常用的藥物有秋水仙堿、別嘌呤醇、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等。這類(lèi)藥物常會(huì)引起胃腸道不良反應(yīng)，對(duì)骨髓有直接抑制作用，且復(fù)發(fā)率高[1-4]。白耙齒菌(Irpexlacteus)屬于多孔菌目(Polyporales)皺孔菌科(Meruliaceae)耙齒菌屬(Irpex)的一種藥用真菌，生于闊葉樹(shù)的枯立木、枯枝上，具有很好的抗菌、消炎和利尿等功效，民間常用其治療腎小球腎炎[5]。白耙齒菌發(fā)酵物已被開(kāi)發(fā)成中成藥益腎康膠囊，用于慢性腎小球腎炎，屬下焦?jié)駸嶙C。在臨床應(yīng)用的過(guò)程中，有一些痛風(fēng)性腎病患者服用后，關(guān)節(jié)疼痛也得到緩解。本實(shí)驗(yàn)建立小鼠高尿酸血癥和大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，研究白耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制，為白耙齒菌新的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(廣州伯齊科技有限公司)；AUY220精密電子天平(日本島津公司)；TDL5M臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥 酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20110321)。白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒以及前列腺素E2(PGE2)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)、血肌酐(Scr)和尿酸(UA)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；白耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物(雙向固體發(fā)酵所得)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)真菌研究室提供；尿酸鈉(Sigma公司)；秋水仙堿片(通化百信藥業(yè)有限公司，批號(hào)140109)；腺嘌呤(天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)20140611)；鹽酸乙胺丁醇(沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司，批號(hào)1407341)；別嘌呤醇(世貿(mào)天階制藥江蘇有限責(zé)任公司，批號(hào)20141217)。

1.3動(dòng)物 健康SD大鼠50只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～250 g，由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004。健康昆明種小鼠50只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由長(zhǎng)春生物制品研究有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)SCXK(吉)2011-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)觀察環(huán)境：溫度24～25 ℃，濕度60%±10%。

2 方法

2.1對(duì)小鼠高尿酸血癥的影響 取小鼠50只，雄性，隨機(jī)分成空白組、模型組、別嘌呤醇組(40 mg·kg-1)及白耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物高、低劑量組(1和0.5 g·kg-1)，每組10只。各組小鼠適應(yīng)1周后，以體質(zhì)量每10 g 0.2 mL連續(xù)灌胃給藥21 d。給藥1周后，除空白組外，其余各組均灌胃造模藥(腺嘌呤100 mg·kg-1、鹽酸乙胺丁醇250 mg·kg-1、酵母膏15 g·kg-1)，連續(xù)造模14 d，造高尿酸血癥模型[6]，空白組給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第21天，小鼠禁食24 h，眼球取血，以3 000 r·min-1離心15 min，取血清備用。小鼠脫頸處死，摘取肝臟，凍存?zhèn)溆谩⒏闻K組織制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿，以2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，測(cè)定肝臟中XOD及ADA活性。取血清，測(cè)定其血清肌酐(Scr)和尿酸(UA)的含量，測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.2對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響 將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿組(秋水仙堿 40 mg·kg-1)、白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組(1 g·kg-1)和白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組(0.5 g·kg-1)5組，每組10只。藥物均溶于生理鹽水中給藥，各組大鼠均連續(xù)灌胃14 d。

除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠右后肢均用乙醇消毒，以無(wú)菌操作的方法，將體積分?jǐn)?shù)為5%的尿酸鈉混懸液0.2 mL，注射入大鼠右后肢內(nèi)踝的脛附關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每只大鼠僅注射1次[7-8]。分別于造模后6，12，24，30，36，48，54，60和72 h測(cè)定大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度；給藥14 d后，眼眶取血3～4 mL，以3 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清液，ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2的水平，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

踝關(guān)節(jié)組織在體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林中固定后，脫鈣，石蠟包埋，切成4 μm的厚度，二甲苯脫蠟，梯度乙醇漂洗，蘇木精和伊紅染色(H&E)，在200倍光鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1對(duì)小鼠高尿酸血癥的治療作用 白耙齒菌固體發(fā)酵物能顯著降低高尿酸血癥小鼠血酸與血肌酐的含量以及小鼠肝臟XOD與ADA的活性。見(jiàn)表1。

3.2對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用 白耙齒菌固體發(fā)酵物可顯著降低大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平，見(jiàn)表2。

表1白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)高尿酸血癥小鼠Scr、UA、XOD和ADA的影響

組別劑量/g·kg-1Scr/U·mg-1protUA/mg·L-1XOD/U·g-1protADA/U·mg-1prot空白組-34.06±6.3143.75±3.8523.98±4.838.90±1.82模型組-36.16±9.5556.41±3.85▲34.31±7.15▲▲14.20±4.03▲▲別嘌呤醇組0.0416.81±3.82**38.96±5.91**18.50±4.65**9.45±5.21*白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組1.005.80±2.44**41.56±4.74*19.42±4.47**5.80±2.44**白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組0.507.23±1.81**42.86±2.78*17.15±4.89**7.23±1.81**

注：與空白組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。-表示未給藥。

表2白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的影響

Tab.2 Effects of solid fermentation products ofIrpexlacteuson IL-1β，IL-6，TNF-αand PGE2in mice with gouty arthritis

組別劑量/g·kg-1IL-1β/ng·L-1 IL-6/ng·L-1TNF-α/ng·L-1PGE2/ng·L-1空白組-1.91±0.3672.20±17.74215.90±36.40478.34±47.57模型組-2.24±0.19▲99.89±15.89▲▲297.03±33.42▲▲533.83±42.10▲▲秋水仙堿組0.042.02±0.16*95.28±22.05259.38±18.34*472.19±63.98*白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組1.001.97±0.30*51.50±23.00**154.81±40.63**426.77±57.33**白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組0.502.01±0.47*79.26±22.65*182.30±56.61**435.27±80.60**

注：與空白組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。-表示未給藥。

病理學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，空白組關(guān)節(jié)表面被覆薄層透明軟骨，細(xì)胞排列整齊、無(wú)變性、壞死，關(guān)節(jié)腔清晰。關(guān)節(jié)囊由結(jié)締組織構(gòu)成，表面覆有1～4層滑膜細(xì)胞，細(xì)胞無(wú)變性、壞死，無(wú)增生。模型組可見(jiàn)明顯的滑膜組織充血，有血管翳或痛風(fēng)結(jié)晶，中度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。秋水仙堿組滑膜組織輕度充血、伴輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)。白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組有1只滑膜組織中度充血、滑膜細(xì)胞輕度被侵蝕，其他樣本無(wú)明顯病變。白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組有1只滑膜組織中度充血、局部中度微增生，其他樣本無(wú)明顯病變。

圖1大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查結(jié)果

A.空白組；B.模型組；C.秋水仙堿(40 mg·kg-1)；D.白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組(0.5 g·kg-1)E.白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組(1 g·kg-1)。

Fig.1 Results of histopathological examination of ankle joint of rats

A.blank group；B.model group；C.colchicine(40 mg·kg-1)；D.drug low dose group of solid fermentation product ofIrpexlactues(0.5 g·kg-1)；E.drug high dose group of solid fermentation product ofIrpexlactues(1 g·kg-1).

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高尿酸血癥模型組小鼠血清尿酸(UA)水平與正常組小鼠比較顯著升高(P<0.01)，證明造模成功。高尿酸血癥的形成主要是尿酸生成過(guò)多或排泄減少，尿酸由內(nèi)源性和外源性2種途徑產(chǎn)生，外源性尿酸來(lái)源于食物，內(nèi)源性尿酸來(lái)源于核苷酸分解代謝。高嘌呤膳食和體內(nèi)核酸的大量分解均可導(dǎo)致血尿酸升高，內(nèi)源性代謝紊亂較外源性因素更重要[9-10]。嘌呤中的次黃嘌呤和黃嘌呤是尿酸形成的直接前體，在黃嘌呤氧化酶(XOD)的作用下，次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，黃嘌呤氧化為尿酸[11]。XOD是嘌呤核苷代謝途徑的限速酶，主要存在于肝臟中，是調(diào)控尿酸生成的最終環(huán)節(jié)，可連續(xù)氧化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸，直接調(diào)控體內(nèi)尿酸水平[12]。腺苷脫氨酶(ADA)是腺苷酸分解代謝的重要酶之一，ADA活性的增加會(huì)增加機(jī)體內(nèi)黃嘌呤與次黃嘌呤的產(chǎn)生量并引起細(xì)胞毒性[13]，而其活性降低則能提高機(jī)體的抗炎能力[14-15]。白耙齒菌發(fā)酵物和別嘌呤醇均能明顯降低高尿酸小鼠XOD和ADA水平，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制體內(nèi)XOD和ADA活性從而降低體內(nèi)尿酸的生成。

血清肌酐(Scr)是腎功能的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M血肌酐與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明高尿酸小鼠模型未出現(xiàn)腎功能?chē)?yán)重?fù)p傷。但陽(yáng)性藥別嘌呤醇和白耙齒發(fā)酵物各組血肌酐水平均明顯下降(P<0.05)，證明白耙齒菌發(fā)酵物具有保護(hù)腎小球和腎小管功能受損的作用。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 (AGA) 是痛風(fēng)典型的表現(xiàn)形式，關(guān)節(jié)損傷的病理過(guò)程與滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的IL-1β、TNF-α和IL-6等多種細(xì)胞因子密切相關(guān)。受累關(guān)節(jié)由于 TNF-α、IL-1β、IL-6和前列腺素E2(PGE2)等炎癥因子和疼痛因子產(chǎn)生的增加，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨炎癥損傷，出現(xiàn)紅、腫、熱、痛。TNF-α是關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的炎癥介質(zhì)之一，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生和釋放 PGE2，能引起滑膜軟骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞減少蛋白多糖的合成，加速其降解，誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)崩解，加速軟骨吸收和破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙[16-17]。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明造模成功。白耙齒菌發(fā)酵物治療后，AGA大鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2水平顯著降低，表明白耙齒菌發(fā)酵物降低以上炎癥因子水平可能是其發(fā)揮 AGA 治療作用的機(jī)制，與秋水仙堿降低 IL-1β、TNF-α和PGE2水平發(fā)揮抗炎止痛作用相似。秋水仙堿組治療IL-6水平降低不明顯，提示白耙齒菌發(fā)酵物在抗炎止痛方面與秋水仙堿抗炎作用不完全一致。

研究報(bào)道[18]，機(jī)體內(nèi)的 TNF-α和IL-1β2種細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)相互影響，共同參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程。降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎IL-1β和TNF-α的水平，可能會(huì)終止炎性細(xì)胞因子的惡性循環(huán)，是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有效治療的作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究白耙齒菌發(fā)酵物能降低血清 TNF-α和IL-1β的含量，證明白耙齒菌能夠抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心炎癥因子TNF-α和IL-1β的合成，這可能也是其發(fā)揮抗炎作用，治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的重要機(jī)制之一。

病理學(xué)檢查結(jié)果表明，模型組滑膜組織充血明顯，有血管翳或痛風(fēng)結(jié)晶，中度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。秋水仙堿組和白耙齒菌發(fā)酵物藥物組除個(gè)別動(dòng)物有輕微組織損傷外，基本恢復(fù)正常，證明給藥治療各組對(duì)AGA具有確切的治療效果。

綜上所述，白耙齒菌固體發(fā)酵物能顯著降低高尿酸血癥小鼠體內(nèi)的XOD及ADA的活性，降低血清肌酐和尿酸的水平。同時(shí)，由炎癥因子及病理切片結(jié)果可知，白耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)痛風(fēng)的治療效果顯著，而白耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物簡(jiǎn)單易得，具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值。