鄒耀霜 晏強(qiáng) 眭維國 歐明林 陳潔晶 湯冬娥 趙鑫 廖秋燕 戴勇*

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林541004；2. 解放軍第一八一醫(yī)院 腎臟科、全軍器官移植與透析治療中心、廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541002；3. 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518020)

環(huán)狀RNA(circular RNAs, circRNAs)是一類通過反向剪接(backsplice)方式形成的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，大量存在于生物中[1，2]。1976年首次在類病毒中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA分子的形成[3]。20世紀(jì)90年代初期，發(fā)現(xiàn)circRNA是由許多基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，如腫瘤抑制基因DCC，原癌基因est-1和睪丸Sry[4,5]。然而，這些circRNA通常被認(rèn)為是低豐度的，可能代表拼接錯(cuò)誤。circRNA在不同物種中具有保守性，而且存在組織表達(dá)差異，可以作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)結(jié)合miRNA，阻斷miRNA對靶基因的抑制作用，具有開發(fā)疾病新型診斷與治療方法的巨大潛力[6，7]。最近，由于高通量RNA測序和新的計(jì)算方法的發(fā)展，已經(jīng)在各種細(xì)胞系和不同物種中成功鑒定了大量的circRNA。近來人們使用全基因組測序?qū)W方法來研究人類三體征(包括13-三體、18-三體和21-三體綜合征)，以鑒定這些特定非整倍性條件中的每一個(gè)的基因表達(dá)特征。染色體畸變與產(chǎn)前期和嬰兒早期的顯著發(fā)病率和死亡率有關(guān)[8]。18-三體綜合征又稱為愛德華綜合征(Edwards syndrome)，是常見的染色體三體征，是由于人類18號染色體增多1條造成的染色體畸變, 此類患兒臨床特征差異大，可從重度先天畸形到近似正常，嚴(yán)重的臨床特征為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受阻、臉部異常、生長較慢、骨骼反常、心臟和腎臟畸形等[9]。由于18-三體綜合征患兒在胎兒期即存在較高的自然流產(chǎn)率，故新生兒18-三體綜合征的患病率為1/8000～1/6000[10]，不能適應(yīng)社會生活和缺乏正常勞動能力，對家庭及社會造成經(jīng)濟(jì)壓力。因此，探索新的無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查診斷指標(biāo)和方法具有非常重要的臨床意義和商業(yè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年期間在181醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)前篩查提示胎兒異常高風(fēng)險(xiǎn)，以及就診于優(yōu)生遺傳門診具有產(chǎn)前診斷指征為18-三體綜合征的2位孕婦的外周血以及臍帶血為實(shí)驗(yàn)組，對照組為正常的相同孕周的孕婦外周血和臍帶血，年齡30～40歲，孕周28周和32周，混合血樣提取RNA進(jìn)行全基因組測序。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 孕婦了解穿刺存在的危險(xiǎn)后并簽署知情同意書，在B超引導(dǎo)下行臍帶穿刺抽取胎兒臍血1～2ml，分析血紅蛋白成份鑒定為臍血后，按常規(guī)方法培養(yǎng)制片，加1ml血液接種于培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，加秋水仙素，滴低滲液破碎細(xì)胞，加固定液固定離心，去上清加1ml成懸浮液，滴片，顯微鏡下觀察進(jìn)行核型分析。常規(guī)計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，手繪分析4個(gè)核型。如遇異常核型則分析計(jì)數(shù)50個(gè)核型以上。

1.3 測序方法 取診斷為懷有18-三體綜合征胎兒的母親的外周血用Trizol法提取RNA，每個(gè)樣品總量為5個(gè)樣品總量作為RNA樣品制備的材料，使用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)(Nanodrop Technologies，Wilmington，DE)測定分離的RNA樣品的純度和產(chǎn)量。使用HiSeq PE Cluster Kit v4 cBot(Illumina)根據(jù)制造商的說明在cBot簇生成系統(tǒng)上進(jìn)行索引編碼樣品的聚類。簇生成后，在Illumina Hiseq 2500平臺上對文庫制備物進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

通過對比圖1和圖2，發(fā)現(xiàn)圖1第18號多出1條染色體，經(jīng)染色體核型分析圖1診斷為18-三體綜合征，圖2核型分析母親的外周血核型圖。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過刪除、過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)之后，獲得了有效數(shù)據(jù)。對比圖3和圖4可以看出，兩組主要的基因類型主要分布在編碼蛋白質(zhì)上，其他的無明顯變化。值得注意的是，lincRNA對比正常組有上升0.2%，在唐氏綜合征中鑒定出大量lncRNAs差異表達(dá)，與蛋白質(zhì)編碼基因相比，lncRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，P<0.05)，表明lncRNAs在唐氏綜合征中發(fā)揮更重要的作用[11]。lincRNA的升高(如圖4)是否與18-三體綜合征的ceRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有關(guān)系？值得進(jìn)一步探索。反義RNA可通過與靶位序列互補(bǔ)而與之結(jié)合的RNA，或者直接阻止靶序列功能，或改變靶部位構(gòu)象而影響其功能[12]。misc-RNA具有多種功能，包括一些類似酶的催化，參與RNA的形成過程，這些小RNA中的一些也可能作為開關(guān)，開啟和關(guān)閉基因，破壞mRNA來沉默基因[13]。

圖1 18-三體綜合征胎兒臍帶血染色體核型分析

圖2 18-三體綜合征孕婦外周血染色體核型分析

圖3 懷有18-三體綜合征的孕婦母血在已知基因類型的分布情況圖(位圖)

圖4 正常孕婦母血在已知基因類型的分布情況圖(位圖)

圖3、圖4結(jié)果文件說明，在已知基因類型的分布情況。采用HTSeq或Hisat2軟件對該物種樣品不同已知基因類型進(jìn)行覆蓋度分析，使用的模型為維恩圖(union)。根據(jù)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)樣品中各類型基因的的表達(dá)分布，得到reads在已知基因類型上的分布情況。

在circRNA的生物成因中，有幾種被提出的模型，包括剪接的依賴循環(huán)路徑(圖5)。18-三體樣本的環(huán)狀RNA的總數(shù)比正常對照組多，大概是1.3倍，由圖5可知，circRNA來源intergenic占63.20%，比正常人的38.80%多，正常人的circRNA來自外顯子占41.90%，而18-三體征樣本才占2.30%，這與環(huán)狀RNA絕大多數(shù)來源于外顯子，少部分由內(nèi)含子直接環(huán)化形成的特征有關(guān)。

圖5 樣本的circRNA的來源注： exon：環(huán)狀RNA位于已知基因的某一個(gè)外顯子內(nèi)，其序列由breakpoint之間的所有堿基構(gòu)成；intergenic：環(huán)狀RNA位于已知基因的之間，其序列由breakpoint之間的所有堿基構(gòu)成；intron：環(huán)狀RNA位于已知基因的某一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，其序列由breakpoint之間的所有堿基構(gòu)成

圖5統(tǒng)計(jì)了樣本的circRNA的來源: circRNA可以來源于 exon 或 intron 的剪接。

所有circRNA的差異分析結(jié)果顯示(圖6)，樣本和對照組circRNA差異性表達(dá)共有13 278個(gè)，其中包括5007個(gè)上調(diào)，8271個(gè)下調(diào)。從中篩選出log2(Fold_change)差異系數(shù)大于或者等于5的共有7718個(gè)，差異系數(shù)最大(10.826)的為hg38_circ_0028679，以及hsa_circ_0005152、hg38_circ_0028661、 hsa_circ_0001649與hsa_circ_0003570等也有明顯的差異表達(dá)。

圖6 實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異表達(dá)的circRNA

3 討論

研究表明hsacirc 0001649在胃癌(GC)、肝癌(HCC)中顯著差異表達(dá)，并可能成為診斷GC的新的潛在生物標(biāo)志物[14-16]。hsa_circ_0001649在18-三體綜合征與對照組中的顯著差異性表達(dá)上調(diào)具有非常重要的意義，極有可能為18-三體產(chǎn)前診斷的潛在生物標(biāo)記物。此外，hsa_circ_0001649被認(rèn)為可能具有包含miR-1283、miR-4310、miR-182-3p、miR-888-3p、miR-4502、miR-6811-5p、miR-6511b-5p和miR-1972的作用[17]。值得注意的是，18-三體細(xì)胞(包括干細(xì)胞和祖細(xì)胞)的增殖速率受損[18,19]，這可能部分與懷孕早期的流產(chǎn)有關(guān)，18-三體征胎兒的流產(chǎn)率高達(dá)72%[20,21]。大鼠差異表達(dá)基因的比較分析,基于通路的富集分析顯示，18-三體性顯示PI3K / AKT途徑失調(diào)，細(xì)胞周期G2/M DNA損傷檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)以及細(xì)胞死亡和存活，如以及抑制上游調(diào)節(jié)劑TP53[22]。通過基因組富集分析和雙聚類，我們還發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異表達(dá)lncRNA與線粒體功能密切相關(guān)。目前對環(huán)狀RNA功能的研究主要集中在競爭性內(nèi)源性RNA (ceRNA)上。circRNA影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的功能主要通過被當(dāng)做海綿吸附miRNA來實(shí)現(xiàn)的[23]。

我們使用了全基因組測序的方法選擇性分析了懷有18-三體綜合征的孕婦的外周血中circRNA的差異性表達(dá)，對18-三體綜合征和正常細(xì)胞增殖控制中的作用，涉及增殖控制和細(xì)胞凋亡的過程對三體征息息相關(guān)。值得注意的是，hsa_circ_0001649的表達(dá)在18-三體與對照組的比對顯著上升，極有可能是18-三體綜合征的產(chǎn)前診斷標(biāo)記物，可能與18-三體綜合征的激活體系相關(guān)，為無創(chuàng)性的18-三體產(chǎn)前診斷提供一定的依據(jù)。Koide K等[24]比較了孕18-三體母細(xì)胞和整倍體胎兒的羊水中的無細(xì)胞胎兒RNA的全球GE(基因表達(dá))，并發(fā)現(xiàn)在18-三體樣品中與細(xì)胞死亡網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的基因被下調(diào)。越來越多的證據(jù)表明組蛋白乙酰化參與染色質(zhì)重塑，進(jìn)而影響生物學(xué)過程，包括細(xì)胞凋亡[25]。

18-三體綜合征的檢測仍然是產(chǎn)前篩查的主要目的，circRNA是一個(gè)長期被忽略的RNA種類，最近在新興的非編碼RNA家族中得到了關(guān)注。新一代測序和生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)揭示了人類細(xì)胞中的一萬多個(gè)circRNAs。雖然大多數(shù)這些circRNA的調(diào)節(jié)和功能仍然難以捉摸，但是研究開始探索它們的作用以及某些circRNA的臨床意義。此外，許多circRNA在癌癥和正常組織之間差異表達(dá)，表明這些circRNA可能在癌癥中具有潛在功能和臨床相關(guān)性。然而，circRNA在產(chǎn)前診斷中的研究尚處于起步階段，關(guān)于它們的生物發(fā)生，調(diào)節(jié)和功能還有許多尚未解答的問題。而circRNA的作用機(jī)制還遠(yuǎn)未完全了解。circRNA可能在多個(gè)水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。由于大部分的circRNA是由前體mRNAs產(chǎn)生的，主要被加工成成熟的mRNA，因此circRNAs與其宿主基因之間是否存在不同的調(diào)控和功能是一個(gè)值得探討的課題。此外，這一領(lǐng)域?yàn)楫a(chǎn)前診斷和環(huán)狀RNA治療開辟了新的可能性。

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