劉太行 王應(yīng)雄 丁裕斌

(重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

人類胎盤(placenta)由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結(jié)構(gòu)，是母體與胎兒間物質(zhì)交換的器官。每個(gè)人出生之前都依賴胎盤生存，胎盤不僅擔(dān)負(fù)著胎兒的肺和腎的功能，還負(fù)責(zé)產(chǎn)生重要的激素，維持正常妊娠。雖然，“胎盤是人們了解得最少的一種人類器官，在科學(xué)界人們大多忽視了胎盤的存在”[1]；但是，作為人體的“免疫特區(qū)”，胎盤組織中進(jìn)行的干細(xì)胞分離和功能研究已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代[2]。多能性胎盤干細(xì)胞用來(lái)移植修復(fù)受損或病變器官不僅免疫原性弱，同時(shí)對(duì)機(jī)體免疫還有一個(gè)負(fù)調(diào)控作用，這就給胎盤干細(xì)胞的應(yīng)用提供了一個(gè)非常大的發(fā)展空間，也被大家寄予了無(wú)限厚望。目前科學(xué)發(fā)現(xiàn)的四類主要胎盤干細(xì)胞中，得到廣泛研究和臨床實(shí)驗(yàn)的主要是胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤造血干細(xì)胞。本文將就這兩種胎盤來(lái)源的干細(xì)胞特征及未來(lái)在臨床上的應(yīng)用潛力進(jìn)行介紹并分析其生物學(xué)特性。

1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(PMSCs)

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta-derived mesenchymal stem cells, PMSCs)是一種多能干細(xì)胞，來(lái)源于胚胎發(fā)育早期的中胚層。Jaroscak等[3]首先報(bào)道了關(guān)于胎盤來(lái)源的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)表達(dá)基本相似的細(xì)胞表面標(biāo)志，都具有多向分化潛能，但胎盤貼壁細(xì)胞的同質(zhì)性不如BMSC。隨后，大量的研究發(fā)現(xiàn)胎盤的各個(gè)部位，如臍帶、羊膜、絨毛膜、以及底蛻膜均含有間充質(zhì)干細(xì)胞。不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞有共同的特征，但也存在一些不同之處。目前PMSCs因具有顯著的增殖和多向分化潛能以及獨(dú)特的免疫學(xué)特點(diǎn)，得到廣泛而深入的研究。

1.1 PMSCs的擴(kuò)增與分化 特征PMSCs在形態(tài)上與BMSCs類似，為典型的成纖維細(xì)胞樣，并呈漩渦狀生長(zhǎng)。PMSCs易于分離擴(kuò)增，體外倍增能力旺盛，體外擴(kuò)增至20代，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，在指數(shù)生長(zhǎng)期的倍增時(shí)間約為21～25小時(shí)[4]。PMSCs的擴(kuò)增能力明顯強(qiáng)于成年(平均年齡30歲)健康女性志愿者的BMSCs。PMSCs表達(dá)典型的間充質(zhì)抗原，如CD90、CD73、CD105、CD13、CD44、CD29、CD166、CD117、HLA-A，-B，-C、CD49e、CD29等；缺乏造血細(xì)胞表面標(biāo)志 CD34、CD45、CD14、HLA2DR和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志vWF、Flk21、CD31、KDR以及共刺激因子CD80、CD86、CD40L和HLA-DR等。PMSCs[5]還可表達(dá)某些胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA24、TRA21261、TRA21280，提示 PMSCs可能是非常原始的細(xì)胞群，比成體干細(xì)胞(adult stem cells, ASC)具有更廣泛的自我更新和多系分化能力。PMSCs中存在多潛能標(biāo)志物Sox-2、OCT-4、Nanog和SSEA-4[6]，還表達(dá)器官特異性基因 renin、nestin、GFAP、 amylase等基因，但Rex21的表達(dá)隨細(xì)胞代數(shù)增加而消失。體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在不同的誘導(dǎo)條件下，PMSCs可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)元，表明PMSCs具有廣泛的分化潛能[7]。PMSCs即使擴(kuò)增1億倍仍能保持其多向分化能力。由于PMSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下分化為多種細(xì)胞的能力，因而胎盤可作為一種重要的參與組織再生的細(xì)胞庫(kù)，即在組織損傷引起的特殊信號(hào)作用下，PMSCs遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據(jù)不同的損傷信號(hào)沿著不同途徑分化。

1.2 PMSCs的免疫學(xué)特性 PMSCs在免疫學(xué)上有其突出的特點(diǎn)：①免疫抑制作用：PMSCs可抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的部分免疫功能。其作用機(jī)制包括抑制免疫細(xì)胞的增殖、抑制可溶性細(xì)胞因子、抑制細(xì)胞毒性物質(zhì)的分泌。這就使得治療用的PMSCs不僅可以用于自體，也可以用于異體。②“免疫赦免”作用：PMSCs具有抑制同種異體免疫反應(yīng)、降低移植物抗宿主反應(yīng)的作用，在某種程度上，自身能躲過(guò)免疫防御機(jī)制的作用，即“免疫赦免”[8]。③強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用：PMSCs具有較低免疫原性的特點(diǎn)，不表達(dá)CD80、CD86和CD40等T淋巴細(xì)胞活化所需的共刺激分子，僅表達(dá)MHC-I。雖然MHC-I可以激活異物反應(yīng)T細(xì)胞，但是由于缺乏協(xié)同刺激因子，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)受限，因此，最終免疫細(xì)胞對(duì)PMSCs無(wú)細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]。 此外，PMSCs可以與多種免疫細(xì)胞相互作用，抑制有絲分裂原或同種異體抗原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的能力，阻斷單核細(xì)胞成熟為樹突狀細(xì)胞的能力，是其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的另一個(gè)實(shí)例[6]。強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用使得移植的PMSCs在修復(fù)受損組織的同時(shí)，還可以調(diào)節(jié)患者的免疫狀態(tài)。④低免疫原性：PMSCs具有低免疫原性，與同種異體人外周血單核細(xì)胞(PBMC)及異基因動(dòng)物豬的 PBMC共培養(yǎng)，無(wú)刺激細(xì)胞增殖的現(xiàn)象，并通過(guò)非直接接觸的作用方式抑制人同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，這避免了胚胎干細(xì)胞等全能干細(xì)胞致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 PMSCs在相關(guān)疾病治療中的實(shí)驗(yàn)與臨床研究 PMSCs由于其獨(dú)特的干性及免疫調(diào)節(jié)特性，被廣泛應(yīng)用于免疫介導(dǎo)性炎癥的治療及移植修復(fù)受損或病變器官。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的條件下培養(yǎng)。使用包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，全反式維A酸(RA)，抗壞血酸(AA)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的混合物，在體外誘導(dǎo)PMSCs成為多巴胺神經(jīng)元。而且，它們可以誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。當(dāng)用bFGF、RA、AA和IBMX誘導(dǎo)PMSCs時(shí)，它們的形態(tài)變化與神經(jīng)元樣細(xì)胞相似。Park等[11]將分離的PMSCs注入帕金森大鼠模型的紋狀體內(nèi)，在24周的觀察周期內(nèi)可見小鼠的運(yùn)動(dòng)功能幾乎恢復(fù)正常。免疫組化及PET掃描可見分泌多巴胺的細(xì)胞生成，證實(shí)了注入的細(xì)胞在體內(nèi)能向神經(jīng)細(xì)胞分化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了PMSCs的分化潛能和有效的旁分泌效應(yīng)。PMSCs在體內(nèi)存活至少3周，并能促進(jìn)新毛細(xì)血管的形成，小動(dòng)脈的增加及各種促血管生成因子的分泌，從而加速缺血恢復(fù)。PMSCs直接通過(guò)分化為特定細(xì)胞和分泌相關(guān)細(xì)胞因子參與血管生成[12]。Reddy等[13]發(fā)現(xiàn)與臍帶來(lái)源的干細(xì)胞、胎兒骨髓來(lái)源的干細(xì)胞以及脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞比較，PMSCs顯示了最強(qiáng)的成骨能力。PMSCs是人體微環(huán)境的重要組成部分，移植PMSCs可以改變?cè)煅h(huán)境，重建免疫系統(tǒng)，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，與造血干細(xì)胞共移植能可能顯著提高白血病和難治性貧血等的治療效果。

目前國(guó)際上已經(jīng)有很多胎盤來(lái)源干細(xì)胞的臨床研究，在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的最大臨床試驗(yàn)注冊(cè)庫(kù)ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上，至2016年，胎盤干細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)已有22項(xiàng)，主要集中在北美，其中中國(guó)境內(nèi)有4項(xiàng)。治療相關(guān)的疾病包括：多發(fā)性硬化、重型再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、白血病等惡性或非惡性血液疾病，還有2型糖尿病、特發(fā)性肺纖維化、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等非血液系統(tǒng)疾病[14]。

2 胎盤造血干細(xì)胞(placenta-derived hematopoietic stem cell, PHSCs)

胎盤具有造血功能的觀點(diǎn)早已有之(圖1)，Till和McCulloch[15]首次提出了胎盤含有大量具有高度增殖潛力的無(wú)性系造血細(xì)胞。Dancis等[16]第一次證明了小鼠胎盤中含有造血前體細(xì)胞。此后，King等[17]發(fā)現(xiàn)胎盤絨毛膜存在基質(zhì)和血管前體細(xì)胞，其后Demir等[18]從胎盤絨毛膜鑒別出分化成血液細(xì)胞和血管細(xì)胞的血液血管干細(xì)胞。另外，相對(duì)于骨髓來(lái)說(shuō)，胎盤具有更適合造血干細(xì)胞增殖的內(nèi)環(huán)境——包括造血因子的表達(dá)、血管內(nèi)皮的類型、血流切力影響、表面分子的改變、血氧濃度等[19]，都進(jìn)一步說(shuō)明胎盤中可能存在PHSCs。

圖1 人類胎兒及胎盤的造血功能

以人類妊娠起始、妊娠中期到足月期的孕周數(shù)為時(shí)間軸，卵黃囊、AGM(人主動(dòng)脈-性腺-中腎)造血集群、肝臟及胎盤中造血干細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)空順序。紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)代表最早的紅細(xì)胞祖細(xì)胞，多能性祖細(xì)胞能產(chǎn)生紅細(xì)胞及髓樣譜系細(xì)胞[19]。

研究還發(fā)現(xiàn)SALL4和BMI-1等造血相關(guān)基因在胎盤中高表達(dá)[20]。轉(zhuǎn)錄因子Evi1作為造血干細(xì)胞自我更新及多向再植入能力的標(biāo)志因子之一，也在胎盤中顯著表達(dá)[21]。小鼠的胎盤從E9開始成為造血祖細(xì)胞來(lái)源，造血干細(xì)胞數(shù)量在E12.5時(shí)期明顯上升，而在E15.5之后的胎盤中很少有造血干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，此時(shí)干細(xì)胞開始遷移至胎肝。與鼠不同的是，人類從懷孕第6周開始有造血干/祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，在終末期胎盤仍可以發(fā)現(xiàn)，提示人類胎盤是造血干細(xì)胞的重要來(lái)源之一。此后，一系列經(jīng)典實(shí)驗(yàn)證明了胎盤是一個(gè)自主的造血干細(xì)胞的起源，而非由其他造血位點(diǎn)產(chǎn)生然后定植于胎盤。Zeigler等[22]及Corbel等[23]進(jìn)行的兩項(xiàng)單獨(dú)的研究顯示，在建立循環(huán)之前分離的尿囊和絨毛膜具有在外植體培養(yǎng)之后產(chǎn)生髓細(xì)胞和明確的紅細(xì)胞的潛力，提示尿囊和絨毛膜具有獨(dú)立的造血潛能。這些結(jié)果均表明胎盤不僅是造血干細(xì)胞龕，而且也是造血細(xì)胞的源泉。

2.1 PHSCs的生物學(xué)特性 PHSCs表達(dá)許多與胎肝和骨髓來(lái)源造血干細(xì)胞相同的標(biāo)記因子，包括CD34和c-kit。而且，鼠胎盤造血干細(xì)胞表達(dá)的Sca-1也在成體骨髓造血干細(xì)胞中表達(dá)。人類的造血干細(xì)胞真正的表面標(biāo)記至今仍沒有完全確定，但在試驗(yàn)及臨床應(yīng)用中，人們常常把 CD34抗原作為重要標(biāo)志來(lái)鑒定和分離人造血干/祖細(xì)胞。Serikov等[24]第一次證明人類胎盤可以提供大量的PHSCs，這些細(xì)胞表達(dá)其他造血前體標(biāo)志物如CD90、CD38和CD133，但不表達(dá)CD31或KDR。

胎盤獲得的CD34+細(xì)胞百分率是臍帶血的8.8倍，CD34+/CD38-細(xì)胞和CD34+/CD38+細(xì)胞百分率分別是臍帶血的4.6倍和11.9倍，說(shuō)明胎盤組織中含有比臍帶血更豐富的PHSCs。另外，胎盤中的淋巴細(xì)胞總數(shù)、T細(xì)胞(CD3+/CD2+)、B細(xì)胞(CD19-)、Th細(xì)胞(CD3+/CD4+)及Th/Ts比值均明顯低于臍帶血，而CD8+/CD28-抑制性T細(xì)胞則明顯高于臍帶血，說(shuō)明PHSCs的免疫原性要低于臍血和外周血造血干細(xì)胞。

目前，人類足月的胎盤是一個(gè)有活性且具有功能的造血干細(xì)胞很好的來(lái)源，利用胎盤循環(huán)及干細(xì)胞受體阻斷的方法，可以在無(wú)菌狀態(tài)下以非破壞性的方法輕易地取得大量的造血干細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也更進(jìn)一步證明PHSCs可以在免疫缺乏的小鼠重建它的造血系統(tǒng)。利用Serikov等[24]發(fā)展出來(lái)的方法取得PHSCs可以增強(qiáng)臍帶血為主的治療或取代骨髓的移植，都將極大地改變整個(gè)移植領(lǐng)域。

2.2 PHSCs的臨床應(yīng)用潛力 PHSCs是存在于胎盤組織中的一群原始造血細(xì)胞，可以分化形成各種血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等)，是高度未分化的細(xì)胞，也是所有造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的祖細(xì)胞，可潛在用于可治療血液疾病，如急慢性白血病、再生障礙性貧血、地中海貧血和淋巴瘤，部分惡性腫瘤，部分遺傳性疾病等。PHSCs也被用于其他疾病的治療試驗(yàn)，例如，PHSCs中的CD34+細(xì)胞能夠遷移到脊髓受損部位，并向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，從而修復(fù)脊髓損傷。此外，PHSCs移植在治療慢性進(jìn)行性舞蹈病、腦梗死、阿爾茨海默病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、大腦損傷和脊位損傷也在部分實(shí)驗(yàn)中取得療效。PHSCs中還存在著大量的較幼稚干細(xì)胞，向血液系統(tǒng)之外的其他系統(tǒng)分化，如在肝細(xì)胞、心肌、皮膚、軟骨和骨骼肌等。除以上疾病外，還被用于1型糖尿病、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷等代謝障礙和免疫缺陷性疾病的治療[25]。PHSCs以其采集方便、實(shí)物儲(chǔ)存、配型幾率高以及排異反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)被視為骨髓的替代。

2.2.1 取材來(lái)源容易 過(guò)去胎盤常作為廢物被丟棄，故PHSCs的提取對(duì)產(chǎn)婦及新生兒沒有任何影響?；畹腜HSCs也同樣可以由整個(gè)冷凍的胎盤得到，由胎盤組織分離的細(xì)胞在試管內(nèi)可以分化成所有血液的細(xì)胞。分離的PHSCs保存在專業(yè)的低溫冷凍液氮罐中，可以保證其安全和可用性。

2.2.2 配型幾率高 異體造血干細(xì)胞移植需要組織配型相合，無(wú)關(guān)供體間配型相合的幾率僅為15～20萬(wàn)分之一。即便主要組織相容性抗原相合，在很多亞位點(diǎn)也有所不同，也會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，影響移植效果，移植成功率低。而自體應(yīng)用具有完美的組織配型，不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，移植的成功率高，對(duì)于同家族親屬來(lái)講，也有1/2～1/4配型相合的幾率，配型率高。

2.2.3 數(shù)量豐富 臍帶血來(lái)源造血干細(xì)胞存在30kg重使用的瓶頸；骨髓、動(dòng)員后外周血提取的造血干細(xì)胞數(shù)量可供1個(gè)成人使用；胎盤造血干細(xì)胞數(shù)量豐富，從胎盤組織中直接提取的造血干細(xì)胞是臍帶血的8～10倍，可能供小孩自用幾次或1～2個(gè)成人患者進(jìn)行治療。PHSCs有效地解決了移植時(shí)骨髓或者動(dòng)員后外周血來(lái)源不足、臍帶血數(shù)量不夠等技術(shù)難題，是替代骨髓的珍貴生物資源。

2.2.4 PHSCs更為早期，增殖能力強(qiáng)，排斥反應(yīng)低、無(wú)倫理障礙等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，胎盤是包括造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)多種干細(xì)胞的存儲(chǔ)器官，這些干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新及多向分化潛能，免疫原性缺乏或較低，且具有免疫調(diào)節(jié)的特性；更重要的是，這些干細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)更容易獲取和分離，無(wú)倫理方面擔(dān)憂。因此，對(duì)于一系列以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方法來(lái)說(shuō)，胎盤來(lái)源干細(xì)胞在同種同體及同種異體移植治療中具有更廣闊的應(yīng)用前景。但是，目前還需要進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞采集的技術(shù)，提高分離效率和純度，更深入的實(shí)驗(yàn)研究胎盤來(lái)源干細(xì)胞在體內(nèi)、外發(fā)揮效應(yīng)的分子與細(xì)胞機(jī)制，挖掘它們的治療潛力，以便為今后臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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