阿爾祖亞·多力空， 艾尼瓦爾·吾買爾， 努爾乎瑪爾·庫(kù)爾班， 艾再提·克熱木，阿迪力·阿不都熱合曼， 鄔利婭·伊明， 周文婷

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種長(zhǎng)期的、復(fù)雜的血管炎性及代謝紊亂性疾病，作為心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)最主要的病理基礎(chǔ)，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率呈上升和低齡化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康[1]。代謝組學(xué)(metabonomics)是通過(guò)考察外界刺激或干擾對(duì)生物體系內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的性質(zhì)及其含量的變化，系統(tǒng)反映生物體代謝異常信息的一門新興學(xué)科[2]。NMR核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)基于樣品前處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單、多重復(fù)性、樣本量少等優(yōu)勢(shì)[3]，廣泛運(yùn)用于高血壓[4]、高脂血癥[5]、動(dòng)脈粥樣硬化[6]等代謝紊亂性疾病的發(fā)病機(jī)制及防治研究。羅勒(OcimumbasilicumL., OBL)為唇形科(Labiatae)植物羅勒的地上部分，具有抗血栓、降血脂、降血壓、強(qiáng)心安神、健脾腎等作用[7]。本課題組前期研究表明羅勒具有抗氧化[8]、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及抑制血栓形成的作用[9-10]。本研究采用ApoE-/-小鼠飼以高脂飼料建立AS模型，并結(jié)合1H-NMR技術(shù)對(duì)其血清代謝產(chǎn)物變化情況進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)定了脂代謝、糖代謝、氨基酸及能量代謝中主要代謝物的含量變化，篩選差異代謝物從而為AS發(fā)病機(jī)制及羅勒抗AS的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器-80℃超低溫冰箱(中國(guó)海爾公司)；-20℃低溫冰箱(中國(guó)海爾公司),600 MHz核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian公司), Millipore 水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司),低溫臺(tái)式超速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2試藥重水(美國(guó)Cambridge isotop laboratories公司，批號(hào)：20170605)，磷酸氫二鈉(天津市廣復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20160511)，磷酸二氫鉀(天津市廣復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20160924)，乙醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170108)。

1.3藥材羅勒2016年9月采集于新疆吐魯番地區(qū)托克遜縣，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為唇形科(Labiatae)羅勒屬(Ocimum L.)植物羅勒(OcimumbasilicumL.)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ApoE-/-小鼠20只，雄性，6 w齡，體質(zhì)量(20±2)g。具有相同遺傳背景的同周齡C57BL/6J小鼠10只。動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：NO.11400700210013，使用許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，室溫(20±2)℃，濕度30%～40%，自由飲水進(jìn)食。

2 方法

2.1羅勒總黃酮的提取稱取羅勒藥材2 kg，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h。過(guò)濾除沉淀，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，得水混懸液。以1/3水混懸液體積氯仿萃取3次，得氯仿層，減壓蒸干，真空干燥，得羅勒脂溶性組分。再分別以50%乙醇和95%乙醇依次洗脫，合并洗脫液。40℃減壓蒸餾濃縮，冷凍干燥得羅勒總黃酮組分(含量>60%)。

2.2ApoE-/-小鼠的分組及給藥6 w齡雄性ApoE-/-小鼠20只，隨機(jī)分為模型組(灌胃給予蒸餾水10 mL/kg體質(zhì)量)和羅勒總黃酮組(灌胃給予羅勒總黃酮240 mg/kg體質(zhì)量)，全過(guò)程給予高脂飼料(含1%膽固醇、0.2%豬膽鹽、10%豬油、10%蛋黃粉、78.8%基礎(chǔ)飼料)，共計(jì)14 w。6 w齡雄性C57BL/6J小鼠10只作為空白組，全過(guò)程給予普通飼料，同時(shí)灌胃給予蒸餾水(10 mL/kg體質(zhì)量)。

2.3血樣的收集及保存小鼠灌胃給藥14 w，末次給藥前禁食不禁水12 h， 給藥1 h后眼眶靜脈叢取血至1 mL離心管中，室溫下靜置1 h， 3 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL作為血清樣本，再加入400 μL磷酸緩沖溶液(將0.83 g K2HPO4、0.14g NaH2PO4及0.90 g NaCl溶于100 mL超純蒸餾水，均勻混合配成PH為7.0的緩沖溶液)。置于4℃超低溫離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL移至5 mm核磁管中待測(cè)。

2.4血清1H-NMR圖譜測(cè)定及數(shù)據(jù)分析采用核磁共振波譜儀對(duì)小鼠血清進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)，測(cè)試溫度25℃，頻率600 MHz，預(yù)飽和方式抑制水峰，飽和時(shí)間為2s，單次掃描時(shí)間為1.636 s，譜寬10 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 k，掃描次數(shù)為128次。以乳酸化學(xué)位移1.33 ppm雙峰質(zhì)子信號(hào)作為化學(xué)位移參考峰定標(biāo)調(diào)整基線。將1H-NMR圖譜在化學(xué)位移 δ 0～9.0 ppm范圍內(nèi)以δ 0.003 ppm積分區(qū)間進(jìn)行分段積分，除去4.7～5.0 ppm之間的水峰積分值，所有積分值進(jìn)行歸一化處理。導(dǎo)入SIMCA-P+11統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和偏最小二乘判別式法分析(PLS-DA)分析。

3 結(jié)果

3.1各組小鼠血清1H-NMR圖譜按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定正常組、模型組、羅勒總黃酮組小鼠在給藥14 w后血清代謝物的1H-NMR 圖譜，通過(guò)1H-NMR圖譜對(duì)3組小鼠血清中主要代謝物成分信號(hào)進(jìn)行了歸屬，結(jié)果表明3組小鼠血清中主要代謝物成分包括：1.VLDL；2.異亮氨酸；3.亮氨酸；4.纈氨酸；5.異丁酸；6.β-羥丁酸；7.脂類(Lipid)；8.LDL；9.乳酸；10.丙氨酸；11.脯氨酸；12.谷氨酰胺；13.丙酮酸；14.肉堿；15.甲胺；16.檸檬酸；17.肌酸；18.膽堿；19.?；撬?；20.β-葡萄糖；21.α-葡萄糖；22.甘氨酸；23.肌醇；24.賴氨酸。這些代謝物存在于能量、氨基酸、脂質(zhì)代謝等多種生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠血清1H-NMR圖譜

3.2各組小鼠血清代謝物圖譜模式識(shí)別分析結(jié)果將1H-NMR圖譜以PLS-DA和OPLS-DA方法進(jìn)行模式識(shí)別分析，可得到小鼠血清代謝物1H-NMR圖譜的平面散點(diǎn)圖與3D空間分布圖。在SIMCA-P+軟件中，通過(guò)R2X、R2Y和Q2來(lái)表示實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所建立模型的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中R2是所解釋的模型差異，Q2是所預(yù)測(cè)的模型差異。R2、Q2值越接近于1，代表模型擬合度越好，越小代表模型擬合度越差，一般認(rèn)為模型的預(yù)測(cè)結(jié)果達(dá)到“良”的標(biāo)準(zhǔn)必須要Q2>0.4?？瞻捉M和模型組血清代謝物OPLS-DA分析結(jié)果顯示，R2X=0.544， R2Y=0.983，Q2=0.922，說(shuō)明兩組小鼠血清代謝物成分存在差異性。平面散點(diǎn)圖中橫縱坐標(biāo)表示2個(gè)主成分(坐標(biāo)無(wú)單位)，每個(gè)點(diǎn)代表每一個(gè)樣本，2組之間無(wú)交叉，無(wú)重疊，存在差異性，見(jiàn)圖2。空白組、模型組及羅勒總黃酮組小鼠血清代謝物OPLS-DA分析結(jié)果顯示，R2X=0.592， R2Y=0.845，Q2=0.667，說(shuō)明3組小鼠血清代謝物成分存在差異性。3D空間分布圖和平面散點(diǎn)圖中橫縱坐標(biāo)表示2個(gè)主成分(坐標(biāo)無(wú)單位)，每個(gè)點(diǎn)代表每一個(gè)樣本，2組之間無(wú)交叉，無(wú)重疊，存在差異性，見(jiàn)圖3、4。

圖2 空白組和模型組小鼠血清代謝物OPLS-DA平面散點(diǎn)圖

圖3 空白組、模型組、羅勒總黃酮組小鼠血清PLS-DA分析平面散點(diǎn)圖

圖4 空白組、模型組、羅勒總黃酮組小鼠血清PLS-DA分析3D空間分布圖

3.3各組小鼠血清差異性代謝物分析各組小鼠血清主要差異性代謝物有：VLDL、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異丁酸、β-羥丁酸、脂類(Lipid)、LDL、乳酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丙酮酸、肉堿、甲胺、檸檬酸、肌酸、膽堿、牛磺酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、甘氨酸、肌醇、賴氨酸等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清主要差異性代謝物及其相關(guān)系數(shù)

注：s：?jiǎn)畏澹?d:雙重峰 ； t: 三重峰 ；m: 多重峰 ；dd: 雙重雙重峰 ；ddd；雙重雙重雙峰；“↑↓”表示后一組較前一組濃度的升高或降低。

4 討論

三羧酸循環(huán)是糖、蛋白質(zhì)和脂肪徹底氧化分解的共同途徑，研究表明三羧酸循環(huán)中間體與動(dòng)脈粥樣硬化有密切的相關(guān)性[11]。檸檬酸是體內(nèi)三羧酸循環(huán)重要的中間產(chǎn)物。ApoE-/-小鼠血清檸檬酸水平降低，表明三羧酸循環(huán)過(guò)程被抑制，影響機(jī)體正常物質(zhì)代謝與能量代謝。羅勒總黃酮組小鼠血清檸檬酸水平升高，表明三羧酸循環(huán)抑制有一定逆轉(zhuǎn)。肌酸是機(jī)體能量?jī)?chǔ)存和利用的重要化合物，并具有一定降低TC、TG、LDL的作用[12]。ApoE-/-小鼠肌酸較空白組降低，而羅勒總黃酮組小鼠血清肌酸水平升高，表明羅勒總黃酮可能具有一定增加機(jī)體能量?jī)?chǔ)存和供給能力的作用。葡萄糖是機(jī)體的主要能源物質(zhì)，葡萄糖無(wú)氧酵解生成ATP分為兩個(gè)步驟：第一步，葡萄糖分解為丙酮酸；第二步，丙酮酸還原生成乳酸。本研究中模型組小鼠血清葡萄糖含量升高，糖異生增加，證明糖酵解過(guò)程受阻，葡萄糖代謝紊亂，而羅勒總黃酮組有明顯逆轉(zhuǎn)作用。丙酮酸和乳酸作為葡萄糖酵解產(chǎn)物在模型組小鼠血清中均有下降趨勢(shì)，而羅勒總黃酮組2者水平有一定逆轉(zhuǎn)。

當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)能量供應(yīng)不足時(shí)，賴氨酸可分解為葡萄糖，提供體內(nèi)所需能量；賴氨酸還可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)代謝中的肉毒堿，參與能量代謝。本研究中模型組小鼠血清賴氨酸水平顯著降低，羅勒總黃酮組小鼠血清賴氨酸水平升高。谷氨酰胺是體內(nèi)重要抗氧化劑?；撬岬那绑w，可提高機(jī)體抗氧化能力，使組織和器官的自由基損傷減少[13]。模型組小鼠血清谷氨酰胺和牛磺酸含量均減少，而羅勒總黃酮組二者含量增加，表明羅勒總黃酮可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕自由基損傷。膠原是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要成分，而脯氨酸是蛋白膠原的主要成分[14]。模型組小鼠血清脯氨酸水平明顯升高，羅勒總黃酮組小鼠血清脯氨酸水平降低，表明羅勒總黃酮可能通過(guò)減少膠原的合成從而減少動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。脂質(zhì)代謝方面，極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)是形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要原因[15]。本研究中模型組小鼠血清水平VLDL、LDL升高，羅勒總黃酮組小鼠血清VLDL、LDL水平降低。

綜上所述，ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠能量、氨基酸、脂質(zhì)代謝均出現(xiàn)不同程度的紊亂，羅勒總黃酮可能通過(guò)調(diào)節(jié)不同代謝中關(guān)鍵生物標(biāo)志物，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)代謝紊亂起到一定調(diào)控作用，其代謝途徑有待進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。