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冷凍載體對(duì)人卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇結(jié)局的影響

2018-07-20 02:01鞏曉蕓朱玥潔王致輝臘曉琳
關(guān)鍵詞:卵裂玻璃化保護(hù)劑

鞏曉蕓, 趙 靜, 胡 泊, 王 鵬, 朱玥潔, 王致輝, 臘曉琳

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 烏魯木齊 830054)

體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)過程中配子冷凍、卵裂期胚胎冷凍和囊胚期胚胎冷凍是目前符合倫理規(guī)范臨床廣泛應(yīng)用的人類生育能力保存措施,對(duì)不可逆生育能力損傷的保存,避免IVF剩余胚胎的浪費(fèi),提高累積妊娠率等方面有重要意義,其中卵裂期胚胎的冷凍復(fù)蘇占據(jù)主要地位[1]。玻璃化冷凍復(fù)蘇技術(shù)是主要的冷凍方法,它使細(xì)胞在高濃度冷凍保護(hù)劑作用下呈現(xiàn)無序排列的“玻璃態(tài)”,避免冰晶損傷造成的細(xì)胞死亡[2]。但是在臨床應(yīng)用中除了備受關(guān)注的前瞻性安全問題外,高濃度的玻璃化冷凍液對(duì)胚胎發(fā)育的潛在毒性,操作過程的細(xì)節(jié)和冷凍載體的改良也是人胚胎冷凍領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2-3]。本研究對(duì)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2016年間采用葉片(Cryoleaf)載體和閉合型拉細(xì)麥管(closed pulled straw,CPS)載體共860個(gè)周期的冷凍復(fù)蘇資料進(jìn)行對(duì)比, 探討冷凍載體對(duì)卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇結(jié)局的影響,旨在為進(jìn)一步提高人類卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象2016年1-12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行凍融胚胎移植(FET)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)移植2枚常規(guī)體外受精(in vitro fertilization,IVF)胚胎;(2)至少一枚移植胚胎級(jí)別優(yōu)于等于2級(jí)且胚胎細(xì)胞數(shù)目≥6細(xì)胞;(3)內(nèi)生殖器官無器質(zhì)性病變。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)近期內(nèi)分泌功能障礙且服用激素類藥物;(2)子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌癥;(3)全身性疾病。納入符合條件者860個(gè)周期,其中葉片(Cryoleaf)載體組522個(gè)周期,閉合型拉細(xì)麥管(closed pulled straw,CPS)載體組338個(gè)周期。

1.2方法

1.2.1 促排卵方案 所有納入研究的患者均在生殖醫(yī)學(xué)中心使用經(jīng)典長方案、拮抗劑方案或黃體期促排方案進(jìn)行控制性超促排卵,當(dāng)至少有2枚卵泡直徑>18 mm時(shí),給予注射人絨毛膜促性腺激素(human chronic gonadotropin,hCG)10 000 IU或艾澤250 μg,34~36 h后行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)。

1.2.2 解凍周期內(nèi)膜準(zhǔn)備 (1)自然周期:于月經(jīng)第9天或第10天行陰道超聲監(jiān)測(cè),當(dāng)內(nèi)膜厚度>7 mm以上,于排卵日至移植日分別給予黃體酮肌注20、40、60 mg。排卵后3 d行解凍胚胎移植;(2)激素替代周期:于月經(jīng)第3天給予口服補(bǔ)佳樂或芬嗎通6~8 mg/d,月經(jīng)第9天行陰道超聲監(jiān)測(cè),當(dāng)內(nèi)膜厚度>7 mm后給予黃體酮肌注20、40、60 mg直至移植日,3 d后行解凍胚胎移植。

1.2.3 胚胎培養(yǎng) 胚胎培養(yǎng)卵裂期胚胎培養(yǎng)基(Continuous Single Culture,CSC)添加10%血清替代品(serum substitute supplement,SSS)制成胚胎培養(yǎng)液,在3001型號(hào)培養(yǎng)皿中做成多個(gè)20 μL微滴,后覆蓋胚胎培養(yǎng)用礦物油3 mL,放置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中(美國Irvine Scientific公司產(chǎn)品)。

1.2.4 胚胎冷凍復(fù)蘇 冷凍胚胎選擇常規(guī)體外受精方式進(jìn)行受精,取卵后第3天依據(jù)診療常規(guī)中胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胚胎評(píng)分,選擇至少一枚優(yōu)于等于2級(jí)且胚胎細(xì)胞數(shù)目≥6細(xì)胞胚胎進(jìn)行冷凍。

冷凍載體:葉片(Cryoleaf)載體(見圖1,美國Irvine Scientific公司產(chǎn)品)。閉合型拉細(xì)麥管(closed pulled straw,CPS)載體(見圖2,美國Irvine Scientific公司產(chǎn)品)。

圖1 葉片載體

圖2 閉合型拉細(xì)麥管

胚胎冷凍:室溫(24±2)℃操作環(huán)境,冷凍:將胚胎移至平衡液(Equilibration Solution, ES)[(4-(2- Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES)+7.5%乙二醇(ethyleneglycol,EG)+7.5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)+20%SSS)]中,靜置(5~15 min)至細(xì)胞完全膨脹后,轉(zhuǎn)移至玻璃化液(Vitrification Solution,VS)(HEPS+ 15%EG+15%DMSO+20% SSS+0.5 mol/L蔗糖)中靜置60 s:(1) Cryoleaf載體:30 s內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至葉片載體前端迅速投入液氮,插入管套。(2)CPS載體:30 s內(nèi)將含有胚胎的玻璃化液抽吸至CPS管中,迅速封口投入液氮。

胚胎解凍:將胚胎從液氮中取出迅速置于37℃TS解凍液(Thawing Solution,TS)(HEPES+1 mol/L蔗糖+20%SSS)中靜置1 min ,轉(zhuǎn)移至室溫(24±2℃)DS解凍液(Dilution Solution,DS)(HEPES+0.5 mol/L蔗糖+20%SSS)中靜置4 min,轉(zhuǎn)移至室溫(24±2℃)WS解凍液(Washing Solution,WS)(HEPES +20%SSS)中靜置8 min,轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)皿中,放置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.5 解凍胚胎移植后黃體支持 黃體酮針劑60 mg肌注,或雪諾酮黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾,瑞士)90 mg陰道給藥,每日1次連用14 d。14 d后根據(jù)血hCG值和B超檢查結(jié)果調(diào)整用藥。

1.3觀察指標(biāo)包括胚胎復(fù)蘇率、胚胎完全復(fù)蘇率、胚胎種植率、臨床妊娠率。復(fù)蘇胚胎標(biāo)準(zhǔn):≥50%卵裂球存活。卵裂球存活標(biāo)準(zhǔn)為:胞膜完整且胞質(zhì)折光性好,透明帶完整。臨床妊娠標(biāo)準(zhǔn):胚胎移植后4~5 w超聲檢查,見妊娠囊。胚胎復(fù)蘇率(%)=復(fù)蘇胚胎個(gè)數(shù)/解凍后胚胎個(gè)數(shù)×100%;胚胎完全復(fù)蘇率(%)=完全復(fù)蘇胚胎個(gè)數(shù)/解凍后胚胎個(gè)數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;胚胎種植率=妊娠囊個(gè)數(shù)/移植胚胎個(gè)數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.12組患者基本情況比較Cryoleaf載體組和CPS載體組年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、移植日內(nèi)膜厚度,移植胚胎個(gè)數(shù)及移植優(yōu)質(zhì)胚胎個(gè)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 2組患者基本情況比較

2.22組冷凍復(fù)蘇結(jié)局比較Cryoleaf載體組和CPS載體組間胚胎復(fù)蘇率和胚胎種植率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Cryoleaf載體組胚胎完全復(fù)蘇率和臨床妊娠率均高于CPS載體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 2組冷凍復(fù)蘇結(jié)局比較

3 討論

3.1冷凍載體對(duì)人卵裂期胚胎復(fù)蘇的影響胚胎冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是造成胚胎死亡的主要原因,冷凍保護(hù)劑的滲透和交換能避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,減少冷凍物理損傷,但是常溫狀態(tài)冷凍保護(hù)劑自身的毒性又會(huì)對(duì)細(xì)胞造成化學(xué)損傷[2]。權(quán)衡冰晶形成和冷凍保護(hù)劑的毒性是胚胎復(fù)蘇的關(guān)鍵。玻璃化冷凍復(fù)蘇法的優(yōu)勢(shì)在于使用高濃度冷凍保護(hù)劑讓細(xì)胞快速降溫通過冰點(diǎn)溫度,形成玻璃態(tài)避免冰晶形成,但是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)冷凍保護(hù)劑濃度越高對(duì)胚胎復(fù)蘇及發(fā)育潛能影響越差。研究發(fā)現(xiàn)多種冷凍保護(hù)劑組合使用能相互制約其單一的毒性影響,而且分步使用相對(duì)于一步法更為安全[4-6]。而通過冷凍載體提高玻璃化冷凍過程中的降溫速率,使胚胎迅速通過冰晶形成臨界溫度區(qū),同時(shí)減少冷凍保護(hù)劑的接觸劑量,是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。Cryoleaf載體和CPS載體是目前臨床廣泛使用的玻璃化冷凍載體,其設(shè)計(jì)理念是減少承載冷凍保護(hù)劑體積,提高達(dá)到玻璃化狀態(tài)的速率。

本研究結(jié)果表明Cryoleaf載體組的胚胎完全復(fù)蘇率高于CPS載體組,可能與胚胎降溫速度和冷凍保護(hù)劑接觸劑量有關(guān)。一方面使用Cryoleaf載體時(shí),液氮與含胚胎冷凍液直接接觸,相對(duì)于CPS載體與液氮間隔冷凍管壁而言,降溫速度增快;另一方面Cryoleaf載體承載約1 μL冷凍保護(hù)劑而CPS載體承載約2 μL冷凍保護(hù)劑,小劑量的冷凍保護(hù)劑更易熱傳導(dǎo)使胚胎快速達(dá)到玻璃化狀態(tài)提高冷凍速率。但是Cryoleaf載體組胚胎復(fù)蘇率和CPS載體組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示冷凍保護(hù)劑的毒性作用對(duì)胚胎單個(gè)細(xì)胞冷凍復(fù)蘇完整性有影響。

3.2冷凍載體對(duì)人卵裂期胚胎復(fù)蘇后發(fā)育潛能的影響胚胎的發(fā)育潛能是指胚胎復(fù)蘇后持續(xù)生長的能力和著床的能力,更能反映冷凍過程對(duì)胚胎發(fā)育的延伸影響。冷凍解凍過程造成的直觀可見損傷是細(xì)胞溶解,不可見損傷是改變胚胎的代謝和相關(guān)酶的活性[7-8],后續(xù)造成胚胎發(fā)育和著床障礙。研究表明[9],快速完全的玻璃化態(tài)是確保玻璃化冷凍復(fù)蘇效果的關(guān)鍵因素,對(duì)某個(gè)特定的冷凍保護(hù)劑,隨著玻璃化能力的增大其生物化學(xué)毒性也隨之增加,因此在確保完全玻璃化的前提下快速最小劑量接觸冷凍保護(hù)劑成為解決這一矛盾的研究方向。從設(shè)計(jì)上Cryoleaf載體冷凍保護(hù)劑承載劑量和接觸時(shí)間(40 s)遠(yuǎn)小于CPS載體(60 s~90 s),使胚胎在相同濃度冷凍保護(hù)劑的環(huán)境中,以最小劑量快速降溫和復(fù)溫,有利于避免“去玻璃化”的二次損害[6]。本研究結(jié)果顯示,Cryoleaf載體組臨床妊娠率高于CPS載體組(P<0.05),而2組間胚胎種植率并未顯示出相對(duì)CPS載體組的優(yōu)勢(shì)(P>0.05),提示玻璃化冷凍過程對(duì)胚胎的潛在毒性隨降溫速率增加而減少,在一定程度上去除不可逆損傷細(xì)胞,是實(shí)現(xiàn)自然淘汰的有效途徑[10]。而Cryoleaf載體直接接觸未過濾液氮的潛在毒性是否影響胚胎發(fā)育潛能,尚需進(jìn)一步觀察。但是Cryoleaf載體玻璃化冷凍操作的高效率相對(duì)于CPS載體,仍具有一定的優(yōu)越性。

在安全性的前提下,通過改良冷凍載體完善細(xì)節(jié)操作和提高液氮清潔度等環(huán)節(jié),進(jìn)而改善人卵裂期胚胎玻璃化冷凍復(fù)蘇結(jié)局,需要進(jìn)一步臨床研究。

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