王碩

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

在女性人群中乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，每年將近有160萬患者被確診為乳腺癌，其中30%～40%的乳腺癌患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，而超過90%死亡患者發(fā)生乳腺癌轉(zhuǎn)移[1]。我國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)處于中低水平，但是乳腺癌仍然是我國女性最常見的癌癥之一，發(fā)病僅次于肺癌[2]。近年來乳腺癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢，因此對于乳腺癌的研究也越來越多。在研究乳腺癌的過程中動物模型的構(gòu)建是研究的關(guān)鍵所在。腫瘤細胞與小鼠品系的選擇也是建立乳腺癌動物模型的基礎(chǔ)所在，這些選擇都會對小鼠的生物學(xué)活性、成瘤率、生存期、腫瘤的惡化情況起著決定性的作用[3]。目前的報道多為人的乳腺癌細胞系異種移植到裸鼠的動物模型并且成瘤率也比較低，但是對于小鼠的乳腺癌細胞系4T1接種到裸鼠以及BABL/c小鼠身上相互對比的報道研究比較少。因此使用4T1細胞建立裸鼠以及BABL/c小鼠動物模型對于乳腺癌的研究有十分重要的作用[4-7]。本文就對相同濃度的4T1細胞分別接種到裸鼠和BABL/c小鼠身上產(chǎn)生的不同影響進行對比，從而為乳腺癌動物模型的建立起到一個選擇性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和試劑 雌性裸鼠以及BABL/c小鼠各 30只，周齡 3～5周，體質(zhì)量15～18 g，購于南京大學(xué)動物模式研究所，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院SPF動物房；4T1乳腺癌細胞株購于中科院細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清和0.25%胰酶購于美國Gibco公司；PBS溶液用1 L超純 水 加 入 NaCL 8 g、KCL 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.48 g 濃度配置。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng) 4T1細胞（中科院細胞庫）培養(yǎng)于含有 10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，Gibco，美國）的 RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，美國），細胞培養(yǎng)均加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對數(shù)期細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞計數(shù) 首先將計數(shù)板以及蓋玻片擦拭干凈，將蓋玻片蓋在計數(shù)板上；然后將細胞懸液吸出20 μL，滴加在蓋片邊緣，使細胞懸液充滿計數(shù)板與蓋玻片之間（主意蓋玻片與計數(shù)板之間不能有氣泡，也不可將細胞懸液流出）；最后將計數(shù)板靜止2～3 min后，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線的細胞只計左側(cè)和上方的，公式計算：細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104。

1.2.3 乳腺癌4T1細胞懸液的制備 傳代培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細胞系4T1,收集處于對數(shù)生長期的4T1細胞，用PBS清洗1次后，吸干殘余液體，加入0.25%消化，離心，然后再用PBS潤洗兩次，吸去PBS后再加入生理鹽水制備1×106的細胞懸液備用。

1.2.4 動物模型的分組以及構(gòu)建 將新到的10只裸鼠以及10只BABL/c小鼠給予正常飲食飼養(yǎng)5 d后，分別隨機分為4組每組5只，從而得到兩組每組5只的裸鼠（一組進行正常實驗，一組觀察生存期）以及兩組每組5只的BABL/c小鼠（一組進行正常實驗，一組觀察生存期）。將1×106個4T1細胞用生理鹽水稀釋后，用注射器注射到小鼠的第四脂肪墊上。

1.3 觀察指標 注射4T1細胞后，每天觀察小鼠的生活飲食以及接種部位的腫瘤生長情況，包括腫瘤出現(xiàn)的時間，腫瘤形成的大小，成瘤率以及遠期的存活率。每間隔5 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并且根據(jù)V=ab2/2計算腫瘤的體積，繪制生長曲線。第30天時頸椎脫臼處死一組裸鼠一組BABL/c小鼠，取出腫瘤組織，用游標卡尺測量腫瘤的長短徑，計算體積，然后4%甲醛固定備用做H&E切片。取出小鼠的肺組織觀察記錄肺部表面的結(jié)節(jié)數(shù)量，然后用4%甲醛固定備用做H&E切片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05（*P＜0.05，**P＜0.01）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別小鼠的成瘤率以及成瘤時間 接種4T1細胞后裸鼠出現(xiàn)腫瘤的時間要早于BABL/c小鼠，由于BABL/c小鼠存在免疫能力使得裸鼠的成瘤率要高于BABL/c小鼠,具體成瘤率與腫瘤形成時間見表1。

表1 成瘤率及成瘤時間Tab 1 Tumor growth rate and tumor formation time

2.2 腫瘤大小統(tǒng)計以及病理觀察 實驗結(jié)果表明在相同細胞濃度的條件下裸鼠形成腫瘤的大小明顯比BABL/c小鼠形成的腫瘤大（圖1）。兩組原位瘤用4%的甲醛固定3 d后做HE染色，比較兩組模型鼠形成的原位瘤組織學(xué)是否有區(qū)別，發(fā)現(xiàn)BABL/c組與裸鼠組形成的原位瘤都存在大量的血管結(jié)構(gòu)，沒有明顯的組織學(xué)差異（圖2）。

圖1 原位瘤的大小及統(tǒng)計Fig 1 Size and statistics of primary tumor

圖2 原位瘤HE染色Fig 2 HE staining of primary tumor

2.3 小鼠肺轉(zhuǎn)移 在30 d頸椎脫臼處死小鼠取原位瘤的同時取肺器官，然后用4%甲醛固定后觀察發(fā)現(xiàn)在肺表面都會有肺結(jié)節(jié)的存在，并且在30 d時裸鼠肺部正反雙面形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯多于BABL/c小鼠（圖3）。HE染色組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在兩組實驗小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞并沒有明顯差異（圖4）。

圖3 形成的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)及數(shù)量統(tǒng)計Fig 3 Lung metastasis nodules and the statistics of nodules number

圖4 肺轉(zhuǎn)移HE染色Fig 4 HE staining of lung metastasis

2.4 小鼠生存期 剩余兩組小鼠用于觀察生存期，發(fā)現(xiàn)在相同的飼養(yǎng)條件下BABL/c小鼠的生存期明顯比裸鼠的生存期長（圖5）。

圖5 小鼠的生存期Fig 5 Survival of mice

3 討論

乳腺癌動物模型的構(gòu)建與選取對于乳腺癌的研究來說一直是重點所在，由于大家對乳腺癌的研究方向不同，所選取的乳腺癌動物模型也不都是相同的[6，9]。在進行乳腺癌相關(guān)實驗時，細胞系的選擇以及小鼠品系的選擇是進行體內(nèi)實驗的基礎(chǔ)，如果細胞系和小鼠品系的選擇不合適可能就會耽誤實驗進程影響實驗結(jié)果。現(xiàn)如今技術(shù)所能構(gòu)建的乳腺癌模型主要有自發(fā)性乳腺癌動物模型，誘發(fā)性乳腺癌動物模型，移植性乳腺癌動物模型，基因工程乳腺癌動物模型以及遠處轉(zhuǎn)移乳腺癌動物模型[10]。

本文通過研究小鼠乳腺癌細胞4T1對不同品系小鼠乳腺癌模型的影響，發(fā)現(xiàn)在注射相同數(shù)量小鼠的乳腺癌細胞4T1時，裸鼠的成瘤速度快于BABL/c小鼠，成瘤率要高于BABL/c小鼠，裸鼠的成瘤大小大于BABL/c小鼠，裸鼠的生存期比BABL/c小鼠要短。兩種小鼠在4T1細胞構(gòu)建的乳腺癌模型中都會發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，但是在相同時間內(nèi)裸鼠形成的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯比BABL/c小鼠多。

綜上實驗結(jié)果,如果實驗要求觀察短時間內(nèi)某基因?qū)δ[瘤的大小的影響，可以選擇4T1細胞注射裸鼠；如果實驗要求動物模型的生存期較長，可以選擇4T1細胞注射BABL/c小鼠；如果實驗要求觀察某基因?qū)游锬Ｐ头无D(zhuǎn)移存在的影響，可以選擇裸鼠。因此，我們在選擇乳腺癌動物模型的時候要根據(jù)實驗具體的需求而定。