張路漫 ，田 剛 ，魏殿軍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市公安醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300010；3.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300211；4.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津300010）

近年來由于工作節(jié)奏的加快和生活環(huán)境的變遷，影響女性身心健康的惡性腫瘤發(fā)病呈上升趨勢(shì)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤占女性新發(fā)癌癥總數(shù)的將近一半。乳腺癌居女性各類惡性腫瘤死亡率之首，侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤加重病情變化的主因，如何早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌病灶，抑制瘤細(xì)胞血道淋巴道遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移成為各研究機(jī)構(gòu)的焦點(diǎn)問題。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）家族配體中Artemin（ARTN）作用獨(dú)特，目前的研究表明，ARTN是一個(gè)癌基因，在不同的腫瘤組織中表達(dá)水平有所不同，該基因在腫瘤組織中的異常激活可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[1]。ARTN在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，國(guó)內(nèi)尚少見報(bào)道。本研究試圖從ARTN角度探索其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為早期診斷乳腺癌遏制其發(fā)生提供一些有價(jià)值數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞系 乳腺癌組織標(biāo)本來自天津市公安醫(yī)院2000年6月-2010年6月手術(shù)切除的39例乳腺癌患者。其對(duì)應(yīng)的乳腺癌旁正常組織標(biāo)本作為對(duì)照組。調(diào)閱住院乳腺癌患者病歷，結(jié)合隨訪資料完善基本資料分析。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone公司）；Artemin（abcam Biotechnology公司）；兔抗人β-actin多克隆抗體（Invitrogen公司）。超凈工作臺(tái)（細(xì)胞培養(yǎng)專用，中國(guó)Air Tech）；Olympus IX70倒置顯微鏡（日本 Olympus）；轉(zhuǎn)膜儀：(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng) (Kodak 440CF)；ID KODAK凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Kadak公司）；Transwell小室（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231用含 10%NBS、100 μg/mL 鏈霉素、100 U/mL 青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中每48 h更換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，胰酶消化成熟細(xì)胞后清洗死細(xì)胞，用1 mL完全培養(yǎng)基終止消化后吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，接種到6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準(zhǔn)備后序試驗(yàn)。

1.2.2 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的適量細(xì)胞平鋪到培養(yǎng)皿中，溫箱培養(yǎng)24 h；用移液槍旋轉(zhuǎn)加入 1.6 μg 質(zhì)粒和 4 μL Lipofectamin 2000，混勻后室溫放置20 min；細(xì)胞表面滴加質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，輕輕搖勻培養(yǎng)皿后放5%CO2孵化箱內(nèi)培養(yǎng)，6 h后換成普通1640培養(yǎng)液；細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后傳代；貼壁細(xì)胞加入HygromycinB，熒光篩選單克隆細(xì)胞[2]。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)Artemin表達(dá) 應(yīng)用免疫組化檢測(cè)臨床乳腺癌標(biāo)本石蠟切片中Artemin蛋白表達(dá)情況。按照操作說明書進(jìn)行，染色淺黃至棕黃色為陽性細(xì)胞。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞平鋪6孔培養(yǎng)板孵育過夜，待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鋪滿培養(yǎng)皿后，沿比例尺用移液槍對(duì)培養(yǎng)基中貼壁細(xì)胞劃線。散落的破碎細(xì)胞用PBS沖洗，加入無血清培養(yǎng)基放培養(yǎng)箱中饑餓細(xì)胞。0 、6、9、12、24 h 測(cè)量劃痕處細(xì)胞愈合距離，不同的測(cè)定點(diǎn)取均值后繪制曲線。

1.2.5 趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 在趨化小室的下室加入用含0.5%精制胎牛血清的培養(yǎng)液配置不同濃度的EGF溶液，混勻的細(xì)胞懸液加入上室。37℃CO2培養(yǎng)箱孵育2 h后棄去未粘附細(xì)胞，固定染色后倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞。

1.2.6 粘附實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后離心，重懸于培養(yǎng)基配成密度為2.7×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液。不同濃度EGF刺激后冰浴終止反應(yīng)，固定染色后鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell小室中加入已融化的Matrigel膠。將細(xì)胞重調(diào)濃度加入上室，下室加入含10%血清的培養(yǎng)基，37℃孵育48 h后，去除未穿膜的細(xì)胞，固定細(xì)胞后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 研究資料用SPSS 11.0軟件進(jìn)行處理，組間比較采用方差分析或t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)Artemin在乳腺癌組織中表達(dá) 39例乳腺疾病患者其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的26例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的13例。在26例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，有24例Artemin表達(dá)陽性（P=0.003）。然而，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例病例中，只有1例Artemin表達(dá)陽性（圖1）。提示Artemin的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)Artemin的表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)。

2.2 siRNA技術(shù)分析MDA-MB-231細(xì)胞中Artemin表達(dá)情況

2.2.1 Artemin降表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA231細(xì)胞而獲得siATRN-MDA231，同時(shí)用一段無關(guān)序列轉(zhuǎn)染MDA231細(xì)胞作為陰性對(duì)照（scr表示）。用Western blot檢測(cè)Artemin的表達(dá)情況。和scr/MDA231細(xì)胞比較，siATRN-MDA231細(xì)胞Artemin的蛋白表達(dá)水平明顯降低。

2.2.2 Artemin表達(dá)降低對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和定向運(yùn)動(dòng)能力影響 siATRN-MDA231細(xì)胞遷移和定向運(yùn)動(dòng)能力明顯比對(duì)照組降低（圖2）。

2.2.3 Artemin降表達(dá)對(duì)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)影響 Artemin降表達(dá)的細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力降低（圖3）。

2.2.4 Artemin降表達(dá)對(duì)MDA231細(xì)胞粘附能力影響 粘附于纖維粘連蛋白的scr/MDA231細(xì)胞數(shù)量在EGF刺激下經(jīng)5和15 min的不同間隔明顯增加。siATRN-MDA231細(xì)胞經(jīng)過相同的EGF刺激時(shí)間間隔有較少的數(shù)量增加（圖4）。

圖4 Artemin降表達(dá)對(duì)MDA231細(xì)胞粘附能力影響Fig 4 Effect of Artemin down-expressin on adhesion of MDA231

2.2.5 siATRN-MDA231細(xì)胞侵襲能力觀察 對(duì)照組和siATRN-MDA231細(xì)胞平均視野侵襲細(xì)胞數(shù)量之比為250.65/52.22個(gè)，siATRN-MDA231細(xì)胞穿透matrigel膠的能力明顯低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比侵襲能力下降了 76.5%（P＜0.01）（圖5）。

圖5 siATRN-MDA231細(xì)胞侵襲能力變化Fig 5 Change in invasion of siATRN-MDA231 cells

3 討論

在西方乳腺癌是最普通的惡性腫瘤之一，在患有惡性腫瘤的婦女死亡病例中位于第二位。近年來我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。如何預(yù)防乳腺癌發(fā)病，特別能盡早有效抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，是治療乳腺癌的關(guān)鍵問題。

Artemin（ARTN）是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）家族配體，目前的研究表明，ARTN是一個(gè)癌基因，在不同的腫瘤組織中表達(dá)水平有所不同，該基因在腫瘤組織中的異常激活可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。研究表明：ARTN與非神經(jīng)源性惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)ARTN在消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲能力，進(jìn)一步的研究證實(shí)ARTN是神經(jīng)旁分泌的重要調(diào)控因子[5]。在生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的研究中國(guó)外學(xué)者研究證實(shí)ARTN在多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，過表達(dá)該基因的乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力、侵襲能力均明顯增加；高表達(dá)ARTN的患者總生存率明顯低于陰性患者，且與腫瘤的復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)明顯高于正常的子宮內(nèi)膜組織，進(jìn)一步的研究表明，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞高表達(dá)ARTN增加細(xì)胞的侵襲能力可能與AKT1表達(dá)水平的增高相關(guān)[7]。

本研究對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織切片進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，Artemin在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)差別明顯，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織處Artemin染色深棕黃色，預(yù)示表達(dá)水平偏高。說明Artemin的表達(dá)水平的高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否關(guān)系密切。這些充分印證Artemin參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

在乳腺癌細(xì)胞系MDA231中，下調(diào)Artemin的乳腺癌細(xì)胞的遷移和定向運(yùn)動(dòng)能力與對(duì)照組相比明顯降低，乳腺癌細(xì)胞的趨化和粘附能力也顯著下降。siATRN-MDA231細(xì)胞穿透matrigel膠的能力明顯低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比侵襲能力下降了76.5%（P＜0.01）。表明Artemin對(duì)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移作用是不可或缺的。

乳腺癌發(fā)病機(jī)制主要涉及腫瘤細(xì)胞的粘附、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解、新生血管形成及癌基因和腫瘤抑制基因的異常表達(dá)等方面。癌細(xì)胞基因調(diào)控存在于染色體水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平中一個(gè)或多個(gè)層次，其中以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控最為重要。ATRN在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，國(guó)內(nèi)尚少見報(bào)道。本研究試圖從ATRN角度探索其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為遏制乳腺癌發(fā)生提供一些有價(jià)值的信息。