閔少菊，劉　念，譚玉潔

近年來(lái)，隨著人口大規(guī)模流動(dòng)及多重耐藥結(jié)核菌菌株的出現(xiàn)，肺結(jié)核疫情呈上升趨勢(shì)［1－3］。 傳統(tǒng)檢測(cè)方法如PPD試驗(yàn)，受卡介苗接種影響導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率偏高，痰涂片陽(yáng)性檢出率較低，難以滿足臨床診療的需要，如何快速、準(zhǔn)確診斷肺結(jié)核已成為臨床醫(yī)師和檢驗(yàn)醫(yī)師重點(diǎn)關(guān)注和亟待解決的問(wèn)題。以T細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的TB－IGRA試驗(yàn)在結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)中應(yīng)用較廣［4，5］。 TB－IGRA 是利用在大部分的非結(jié)核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌（包括卡介苗）中均不存在，而在結(jié)核分枝桿菌中存在的菌種特異性抗原，體外刺激活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生 IFN－γ的原理而建立［6］。因此，TBIGRA特異性比PPD高得多，使其在臨床得到廣泛應(yīng)用［7］。該研究通過(guò)TB－IGRA試驗(yàn)測(cè)定活動(dòng)性肺結(jié)核組、非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組和健康對(duì)照組特異性IFN－γ水平，繪制ROC曲線，探討TBIGRA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷和鑒別診斷價(jià)值，并與結(jié)核桿菌抗體和痰涂片抗酸染色方法進(jìn)行比較，分析TB－IGRA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值。

1　資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源選取筆者所在醫(yī)院2016年1—12月進(jìn)行TB－IGRA試驗(yàn)住院患者280例。分為活動(dòng)性肺結(jié)核組120例，其中男72例，女48例；平均年齡（44．30±19．18）歲。 非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組160 例，男 95 例，女 65 例；平均年齡（58．24±17．49）歲。47名健康對(duì)照組為該院同期健康體檢者，男21名，女 26 名；平均年齡（50．51±10．16）歲。 活動(dòng)性肺結(jié)核組根據(jù)我國(guó)2008年修訂的 《結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)和分類(lèi)》確診分類(lèi)，非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組標(biāo)本來(lái)源于同期入院的結(jié)核菌涂片陰性的肺部疾病住院患者。健康對(duì)照組由本院體檢X線胸片無(wú)異常，無(wú)結(jié)核病臨床癥狀，同時(shí)排除心、肝、肺、腎等疾病的健康人群。

1.2儀器與試劑結(jié)核菌染色液（珠海貝索生物有限公司）、人結(jié)核桿菌IgG抗體檢測(cè)（膠體金法）試劑盒（北京貝爾）及結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（北京萬(wàn)泰）。ST－360酶標(biāo)儀和洗板機(jī) （上?？迫A）、BSC1500ⅡB2－X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西）、電熱恒溫培養(yǎng)箱和電熱恒溫水浴箱等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1結(jié)核分枝桿菌γ－干擾素體外釋放試驗(yàn)（TBIGRA）使用BD生產(chǎn)肝素抗凝的真空采血管采集全血至少4 ml；將標(biāo)本輕柔顛倒混勻后分裝到陰性對(duì)照、測(cè)試及陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管中，1 ml/管；顛倒混勻后立即放入37℃培養(yǎng)（22±2）h。將培養(yǎng)管3000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取血清用ELISA法檢測(cè)IFN－γ含量。應(yīng)用北京萬(wàn)泰公司提供的自動(dòng)計(jì)算軟件，輸入校準(zhǔn)品濃度和校準(zhǔn)品OD值繪制相應(yīng)曲線，要求每次實(shí)驗(yàn)所得曲線的相關(guān)系數(shù)R2＞0．99，在軟件中輸入樣本OD值后計(jì)算IFN－γ含量，并由軟件自動(dòng)判定陰陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.2結(jié)核桿菌抗體（TB－Ab）實(shí)驗(yàn)方法將待檢測(cè)標(biāo)本 （檢測(cè)TB－IGRA后肝素抗凝管內(nèi)全血3000轉(zhuǎn)/min離心10 min后分離出的血清）100μl加到檢測(cè)孔中，15～20 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.3.3痰涂片抗酸染色法囑患者清晨用清水漱口后咳出肺深部的痰液，痰量不少于3 ml，置于專(zhuān)用有蓋痰盒內(nèi)，專(zhuān)人及時(shí)送檢。在生物安全柜中制備痰涂片并于紫外燈下照射1 h待其自然干燥；5%苯酚復(fù)紅初染、3%酸性乙醇脫色和亞甲基藍(lán)溶液復(fù)染。先用低倍鏡觀察全片，再用高倍鏡鏡檢，至少觀察300個(gè)高倍鏡視野。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19．0軟件處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以α＝0．05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。繪制ROC曲線，以Youden指數(shù)最大時(shí)的IFN－γ含量為最佳臨界值，并計(jì)算其靈敏度和特異性。

2　結(jié)果

2.1各組IFN-γ水平比較活動(dòng)性肺結(jié)核組IFN－γ 水平［（156．86±128．19） pg/ml］，明顯高于健康對(duì)照組［（22．15±71．52） pg/ml］和非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組［（55．31±103．39） pg/ml］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－8．593，t＝－7．115，均為 P＜0．05）；非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組IFN－γ水平高于健康對(duì)照組，以α＝0．05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2．502，P＜0．05）。

2.2三種檢測(cè)方法結(jié)果陽(yáng)性率比較TB－IGRA在活動(dòng)性肺結(jié)核組陽(yáng)性率顯著高于非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組和健康對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。在活動(dòng)性肺結(jié)核組中，三種方法的陽(yáng)性檢出率以 TB－IGRA最高，為 88．33%，且與結(jié)核抗體和痰涂片抗酸染色結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 見(jiàn)表 1。

2.33種不同檢測(cè)方法對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷效能評(píng)價(jià)TB-IGRA的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值分別為88.33%和90.79%，均高于其他兩種方法，而特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均低于其他兩種方法。見(jiàn)表2。

2.4繪制ROC曲線以活動(dòng)性肺結(jié)核組為陽(yáng)性組，健康對(duì)照組和非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組為陰性組繪制ROC曲線A；以活動(dòng)性肺結(jié)核組為陽(yáng)性組，健康對(duì)照組為陰性組曲線B。兩條曲線的靈敏度相同，但是曲線B的特異度明顯高于曲線A，這是因?yàn)樘蕹朔腔顒?dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組作為陰性對(duì)照結(jié)果后，大大提高了TB-IGRA檢測(cè)的特異度。見(jiàn)表3。

表 1　3種檢測(cè)方法陽(yáng)性率分析

表 2　3種檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

表 3　不同ROC曲線的比較

3　討論

TB-IGRA是利用人體感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)致敏T淋巴細(xì)胞再次受到相同抗原刺激后，可迅速產(chǎn)生大量IFN-γ，檢測(cè)IFN-γ含量可間接反映體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌感染情況［8-10］。該方法與傳統(tǒng)結(jié)核桿菌感染診斷方法比較具有快速、簡(jiǎn)便及利于批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，且選用的CFP10/ESAT6特異性蛋白可有效避免卡介苗接種后的假陽(yáng)性結(jié)果。

該研究結(jié)果表明，活動(dòng)性肺結(jié)核組IFN-γ水平均明顯高于非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組和健康對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明人體感染結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核后，血漿的IFN-γ水平明顯升高［11，12］，提示動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) IFN-γ 水平逐漸升高時(shí)，診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核的可能越大。TB-IGRA目前不能用于區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核、潛伏性結(jié)核感染和陳舊性結(jié)核［13］，而我國(guó)結(jié)核分枝桿菌感染率較高，故非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組和健康對(duì)照組IFN-γ水平升高，與被檢者可能存在陳舊性肺結(jié)核或與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染有關(guān)，但高水平的IFN-γ含量可作為活動(dòng)性肺結(jié)核重要的輔助診斷依據(jù)。

活動(dòng)性肺結(jié)核組三種檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率均顯著高于非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組患者和健康對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)處于活動(dòng)期時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后無(wú)論是細(xì)胞免疫還是體液免疫均產(chǎn)生應(yīng)答，因此三種方法對(duì)結(jié)核感染的診斷均有一定的參考價(jià)值［14］。但活動(dòng)性肺結(jié)核組TB-IGRA的陽(yáng)性率明顯高于結(jié)核桿菌抗體實(shí)驗(yàn)和痰涂片抗酸染色法，且靈敏度最高，但其特異性均低于其他兩種方法，TB-IGRA、結(jié)核抗體和痰涂片抗酸染色法準(zhǔn)確度分別為74.62%、69.72%、75.84%，表明TB-IGRA檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確度。說(shuō)明該方法對(duì)于活動(dòng)性肺結(jié)核早期篩查具有一定臨床價(jià)值。由于我國(guó)人群結(jié)核分枝桿菌感染率偏高，潛伏感染可能性大，使得TB-IGRA檢測(cè)的特異度有所降低。統(tǒng)計(jì)顯示TB-IGRA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核組陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為60.57%，低于其他兩種方法；其陰性預(yù)測(cè)值最高為90.79%，提示TB-IGRA檢測(cè)的陰性結(jié)果對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的排除診斷具有重要作用［15］。

ROC曲線分析TB-IGRA應(yīng)用于活動(dòng)性肺結(jié)核特異性診斷的曲線下面積為0.898，有較高的輔助診斷價(jià)值，本研究結(jié)果顯示當(dāng)IFN-γ臨界值被設(shè)定為19.11 pg/ml時(shí)，其對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核病的輔助診斷具有較高的靈敏度（86.70%）和特異度（87.20%），可用于活動(dòng)性肺結(jié)核組和健康人群的鑒別診斷。在以不同人群為陰性對(duì)照組繪制ROC曲線時(shí)，具有不同的特異度和診斷效能，主要是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”，而非活動(dòng)性肺結(jié)核的呼吸疾病組中可能存在未診斷明確的肺結(jié)核患者，造成診斷特異度的差異。

TB-IGRA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核具有較高的臨床診斷價(jià)值，且血漿IFN-γ的含量較高時(shí)，對(duì)輔助診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床意義較大。同時(shí)，其陰性結(jié)果對(duì)排除活動(dòng)性肺結(jié)核也有重要價(jià)值。