張 慧，于家強，那 威，徐梓純

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖業(yè)中，快大型肉雞生長速度得到了明顯的提高，然而，在肉雞快速生長的同時，腹脂蓄積過多和腹水綜合征等也隨之產(chǎn)生，給肉雞生產(chǎn)者帶來了重大的經(jīng)濟損失[1-3]。其中脂腹脂沉積過多，不僅會降低肉仔雞的飼料轉(zhuǎn)化效率，減少分割肉產(chǎn)量，同時也會降低肉仔雞的商品價格；另外過多的腹脂沉積在加工時會造成環(huán)境污染，并且影響禽類的產(chǎn)蛋率、受精率以及孵化率等[4-5]。因此，降低肉雞腹脂沉積，控制脂肪在畜禽體內(nèi)的過度沉積已成為是家禽遺傳育種工作者亟需解決的問題。

本課題組柳曉峰等[6]以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群體為研究材料，利用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了雞1號染色體連鎖圖譜，并對雞1號染色體上控制體脂和體重性狀的QTL進行了初步定位；并在此基礎(chǔ)上又通過提高標(biāo)記密度和擴大群體規(guī)模的方法對這些QTL進行了精細(xì)定位，結(jié)果將影響雞體脂和體重性狀的QTL分別定位于1號染色體3.7 Mb和5.5 Mb的區(qū)域內(nèi)，并通過生物信息學(xué)分析鑒定出RB1基因等與雞體脂性狀相關(guān)的重要基因[7]。同時本課題組利用Realtime RT PCR的方法檢測了RB1基因在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇品系第十六世代1～7周齡雞只腹部脂肪組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RB1基因在高脂系中的表達量均低于高脂系，且在6、7周齡差異顯著。綜合以上結(jié)果，推測RB1基因可能與雞脂肪組織生長發(fā)育的有關(guān)。

因此，本研究結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果，以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇品系第十一世代雞只為試驗材料，對雞60K SNP芯片上位于RB1基因上的4個SNP位點進行多態(tài)性分析，進而分析與腹脂性狀的相關(guān)性，確定RB1基因上影響雞腹脂性狀的重要突變位點，從而為深入研究RB1基因影響雞脂肪組織生長發(fā)育的遺傳機理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 高、低脂雙向選擇品系第十一世代雞只共計475只雄性個體（低脂系203只，高脂系272只）。雞群按常規(guī)商品肉雞飼養(yǎng)程序統(tǒng)一進行飼養(yǎng)管理，7周齡時稱量活重后屠宰，測定腹脂重，同時計算腹脂率（腹脂率=腹脂重/7周齡活重）。7周齡時翅靜脈采血，苯酚-氯仿法提取基因組DNA后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因型分析將高、低脂系十一世代的475只

2.1 等位基因頻率在高、低脂系間的差異比較RB1基因上4個SNP位點等位基因頻率在高、低脂系間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gga_rs13552715、GGalu-GA054680和GGaluGA054691位點的等位基因頻率在高、低脂系間存在顯著差異（P＜0.05），而GGalu-GA054667位點的等位基因頻率在高、低脂系間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 SN P多態(tài)性與腹脂性狀的相關(guān)分析利用JMP 7.0軟件進行SNP多態(tài)性與雞腹脂重和腹脂率的相關(guān)分析，結(jié)果見表2。由表2可以看到，GGalu-GA054691位點多態(tài)性對腹脂重有顯著影響（P＜0.05），Gga_rs13552715和GGaluGA054667位點多態(tài)性與腹脂重有一定程度的相關(guān)（P＜0.2）；GGalu-個體基因組DNA與雞60K SNP芯片進行進行雜交，獲得基因型數(shù)據(jù)。獲得基因型數(shù)據(jù)后進行基因型質(zhì)量控制，將雜交質(zhì)量不好的位點去掉，最終在雞RB1基因上有4個SNP位點的基因型可以用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.2.2 統(tǒng)計分析根據(jù)試驗材料的群體特點，利用JMP 7.0軟件進行基因型與性狀的關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建基因型效應(yīng)分析的統(tǒng)計模型如下：

其中，Y為性狀觀測值，μ為群體均值，G為基因型固定效應(yīng)，L為品系固定效應(yīng)，F(xiàn)（L）為品系內(nèi)家系的隨機效應(yīng)，D（F，L）為家系與品系內(nèi)母雞的隨機效應(yīng)，e為隨機效應(yīng)。使用統(tǒng)計軟件JMP 7.0檢驗基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計性狀的最小二乘均值。建議顯著水平為P＜0.2，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

利用Haploview 4.1進行位點間的連鎖不平衡分析。

2 結(jié)果與分析

表1 雞RB1基因上4個SNP位點等位基因頻率在高、低脂系間的差異Table 1The differences of allele frequency of 4 SNP loci in chickenRB1gene between the lean and fat lines

表2 雞RB1基因上4個SNP多態(tài)性與腹脂重和腹脂率的相關(guān)分析結(jié)果（P值）Table 2association analysis between four SNPs of chickenRB1gene and abdominal fat weight and abdominal fat percentage

GA054691和Gga_rs13552715位點多態(tài)性對腹脂率有顯著影響（P＜0.05），GGaluGA054667位點多態(tài)性與腹脂率有一定程度的相關(guān)（P＜0.2）；而GGalu-GA054680位點多態(tài)性與腹脂重和腹脂率的相關(guān)程度都沒有達到顯著水平（P＞0.2）。

2.3 連鎖不平衡分析對雞RB1基因上與腹脂性狀有一定程度相關(guān)或顯著相關(guān)的3個SNP位點進行連鎖不平衡程度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gga_rs13552715和GGaluGA054691位點處于強的連鎖不平衡狀態(tài)（r2=0.55＞0.3）（圖1）。說明這兩個位點可能連鎖在一起發(fā)揮作用，對肉雞腹脂沉積有重要的影響。

3 討論

圖1 雞RB1基因上與腹脂性狀相關(guān)的3個SNP位點的連鎖不平衡情況Fig.1Linkage disequilibrium of three SNPs associated with abdominal fat traits in chickenRB1gene

RB1基因作為一個抑癌基因，因其在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中缺失而被發(fā)現(xiàn)[8]，與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤密切有關(guān)，所以又叫視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因。RB1基因編碼PRb蛋白，調(diào)控多個細(xì)胞進程[9]，包括細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖，骨骼肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的分化等[10-12]。

3.1 PRb與細(xì)胞增殖PRb是染色質(zhì)蛋白，其主要通過調(diào)控E2F轉(zhuǎn)錄因子來限制細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，達到對細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控的目的[13]。在細(xì)胞周期的G1期到S期的過渡階段，PRb被磷酸化，釋放E2F，隨后E2F激活細(xì)胞周期相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期順利進行。

3.2 PRb與細(xì)胞分化RB1基因可以對通過對特定基因的轉(zhuǎn)錄激活來調(diào)節(jié)細(xì)胞分化[14]。在人的內(nèi)臟和皮下脂肪組織中，RB1（mRNA、蛋白和活性）與BMI（體重指數(shù)）和胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)，但是與促進脂肪形成的基因的表達（PPARγ、IRS1）呈正相關(guān)。BMI增加主要是由于脂肪含量下降。RB1基因在人脂肪細(xì)胞分化過程中，蛋白質(zhì)的表達量和活性都顯著地增加。在完全分化的人脂肪細(xì)胞中，干擾RB1降低了脂肪細(xì)胞的成脂性[15]。Chen等[16]通過對小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)條件下，有活性的PRb存在時，胚胎成纖維細(xì)胞可以分化成脂肪細(xì)胞；當(dāng)PRb缺失時，胚胎成纖維細(xì)胞不能分化成脂肪細(xì)胞，而當(dāng)使用野生型PRb轉(zhuǎn)染缺失PRb的細(xì)胞時，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞又能夠分化成脂肪細(xì)胞。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因是小鼠成纖維細(xì)胞中PRb能激活C/EBPs家族介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄途徑，從而誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化過程。Classon等[17]在3T3成纖維細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)隨著PRb濃度的增加，C/EBPα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄途徑被激活，細(xì)胞進行分化，缺失PRb的3T3成纖維細(xì)胞分化受到嚴(yán)重阻礙。Cole等[18]在研究3T3-L1前脂肪細(xì)胞系時發(fā)現(xiàn)非磷酸化的PRb能夠抑制C/EBPβ與DNA的結(jié)合活性，過表達PRb能夠抑制C/EBPβ對C/EBPα的轉(zhuǎn)錄激活作用，進而抑制脂肪細(xì)胞分化。以上結(jié)果顯示，RB1對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)在不同的細(xì)胞中可能具有不同的作用。鼠上，PRb不但對白色脂肪細(xì)胞的分化有很重要的作用，同時也是棕色脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控者[19-20]。實際上，鼠上的很多研究結(jié)果都顯示，PRb的失活導(dǎo)致白色脂肪組織棕色化[21-23]。

3.3 PRb與肥胖高脂飲食會對下丘腦ARC（弓狀核）造成損傷。ARC神經(jīng)元在調(diào)節(jié)食物吸收及能量消耗方面發(fā)揮重要作用。下丘腦中的ARC包含2種神經(jīng)元，POMC和AGRP/NPY，分別負(fù)調(diào)控和正調(diào)控能量平衡過程。研究中發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中，高脂飲食抑制PRb，從而解除PRb對E2F靶基因的抑制作用。在POMC神經(jīng)元中，缺失RB1，導(dǎo)致細(xì)胞再進入細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡等過程的發(fā)生；但是在AGRP/NPY神經(jīng)元，缺失RB1并沒有影響。RB1在減少食欲的POMC神經(jīng)元和增加食欲的AGRP/NPY神經(jīng)元中的不同作用，為形成肥胖提供直接的依據(jù)[24]。

本研究中試驗群體為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇品系，這兩個品系有共同的祖先，是通過對腹脂率和血漿中VLDL濃度的進行雙向選擇選育出來的。隨著選擇世代的增加，腹脂性狀差異明顯，理論上和腹脂性狀有關(guān)的等位基因頻率在高、低脂系間也會逐漸分離。本文中，比較RB1基因4個SNP位點等位基因頻率在高、低脂系間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個SNP位點的等位基因頻率在高、低脂系間存在顯著差異。

對RB1基因上4個SNP位點的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，其中的3個SNP位點多態(tài)性與腹脂重和腹脂率存在顯著或一定程度的相關(guān)，進一步連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)兩個位點處于強連鎖不平衡狀態(tài)，說明這兩個位點可能連鎖在一起，對肉雞腹脂沉積有顯著影響。綜合群體遺傳學(xué)分析結(jié)果以及相關(guān)分析結(jié)果，本研究通過試驗證實，RB1基因確實是影響雞腹脂沉積的重要基因。本研究結(jié)果為后續(xù)該基因影響雞腹脂沉積的機制研究奠定了一定的基礎(chǔ)。