陸云梅 黃仁華

摘要：為了闡明采收期對(duì)費(fèi)約果貯藏期間活性氧代謝的影響，確定果實(shí)最佳采收時(shí)期，以品種Coolidge果實(shí)為材料，分析了始熟期（花后130 d）、盛熟期（花后150 d）和過(guò)熟期（花后170 d）采收果實(shí)在貯藏期間果肉線粒體細(xì)胞活性氧代謝及抗壞血酸—谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)的差異。結(jié)果顯示，盛熟期采收的果實(shí)在貯藏后期H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率顯著高于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)，而貯藏前6 d無(wú)顯著差異；同時(shí)，果實(shí)在貯藏前期，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）等酶活性以及抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量變化較小，但9 d后呈迅速增加的變化趨勢(shì)，其中DHAR、GR活性以及AsA和GSH含量增加速率以過(guò)熟期采收的果實(shí)最大，其次為始熟期和盛熟期。因此，針對(duì)果實(shí)貯藏期活性氧代謝及AsA-GSH循環(huán)而言，采收時(shí)間對(duì)費(fèi)約果短期貯藏?zé)o顯著影響，而中長(zhǎng)期貯藏以盛熟期（花后150 d）采收為最佳時(shí)期。

關(guān)鍵詞：采收期；費(fèi)約果；線粒體；活性氧代謝；AsA-GSH循環(huán)

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）11-0050-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.012

Abstract： In order to elucidate the effects of harvest time on active oxygen metabolism of Feijoa sellowiana fruit during storage and determine the best harvest time，the active oxygen metabolism and AsA-GSH cycle in mitochondria of Feijoa sellowiana pulp harvested at initial ripe stage （IRS，130 d after flowering），full ripe stage （FRS，150 d after flowering） and excess ripe stage（ERS，170 d after flowering） were studied during the storage. The results showed that the H2O2 content and O2-· production rate in FRS fruits was significantly higher than those in IRS and ERS fruits during the late storage stage，but there were no significant difference before 6 d storage. At the same time，there were no significant changes in APX，DHAR，GR activities and AsA and GSH contents during the early stage of postharvest storage. After storage 9 d，the rapidly increasing trend in these indexes were showed and the biggest increasing rate was found in ERS fruits，followed by ERS fruits and FRS frruits. Therefore，in the case of active oxygen metabolism and AsA-GSH cycle during the fruit storage period，harvesting time had no significant difference on the F. sellowiana fruits in short-term storage，but for long-term storage，the full ripe stage（150 d after anthesis） was optimal harvesting time.

Key words： harvesting time； Feijoa sellowiana； mitochondria； active oxygen metabolism； AsA-GSH cycle

費(fèi)約果（Feijoa sellowiana Berg.）又名肥吉果、菲油果、南美稔、鳳榴，系桃金娘科，屬常綠灌木或小喬木[1]，起源于巴西最南端、阿根廷北部、巴拉圭和烏拉圭西部的山區(qū)。目前，新西蘭、法國(guó)、西班牙、葡萄牙、意大利、日本等國(guó)均有專門果園種植，其中新西蘭是種植發(fā)展最好的國(guó)家，在中國(guó)，西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院于2004年從新西蘭將其引入四川綿陽(yáng)地區(qū)，經(jīng)過(guò)近十年的馴化引種，已逐步進(jìn)入推廣種植階段[2]。費(fèi)約果果實(shí)芳香，具有人體需要的多種營(yíng)養(yǎng)成分，如礦質(zhì)元素、脂肪酸、維生素、多酚、類胡蘿卜素等[3-5]，是目前國(guó)際市場(chǎng)熱銷的新型水果之一。

經(jīng)過(guò)近十幾年的引種栽培發(fā)現(xiàn)，費(fèi)約果存在果實(shí)成熟期不一致的問(wèn)題，同一品種從始熟期到過(guò)熟期可達(dá)40 d左右。在新西蘭對(duì)費(fèi)約果的采收大多采用自然掉落的方式，很大程度上影響了果實(shí)的上市時(shí)間和貨架期[1]。適宜的采收期對(duì)保持果實(shí)良好的風(fēng)味品質(zhì)以及延長(zhǎng)貯藏時(shí)間具有重要的意義，采收過(guò)早，尚未形成品種固有的品質(zhì)和風(fēng)味，且耐藏性和抗病性差；采收過(guò)遲，果肉風(fēng)味變淡，采后果實(shí)易衰老、不耐貯運(yùn)[6]。目前關(guān)于果實(shí)在貯藏期間衰老的機(jī)理研究主要集中于乙烯對(duì)果實(shí)成熟衰老的調(diào)控[7]，細(xì)胞壁多糖的降解[8，9]、呼吸速率的變化[10，11]等方面，而對(duì)果實(shí)貯藏期衰老過(guò)程中線粒體細(xì)胞活性氧代謝機(jī)制的研究較少。為此，試驗(yàn)針對(duì)不同采收期對(duì)費(fèi)約果貨架期的影響，研究了不同采收期對(duì)費(fèi)約果貯藏過(guò)程中果肉線粒體細(xì)胞活性氧代謝及AsA-GSH循環(huán)的差異，以期為費(fèi)約果的合理采收以及衰老機(jī)理提供新的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而為完善果實(shí)采后貯藏技術(shù)體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

費(fèi)約果果實(shí)采自西南科技大學(xué)西山校區(qū)費(fèi)約果栽培園Coolidge品種，該品種于2004年從新西蘭引進(jìn)，栽培表現(xiàn)良好。2016年于果實(shí)始熟期（花后130 d）、盛熟期（150 d）和過(guò)熟期（花170 d）分別進(jìn)行采摘，采摘時(shí)選擇樹體東、南、西、北4個(gè)方向高度基本一致，果形端正、無(wú)病蟲害、大小均勻的果實(shí)，每次采摘60個(gè)果實(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并用2%的次氯酸鈉消毒處理，2 min后用去離子水洗凈，風(fēng)干，用黑色聚乙烯塑料袋包裝進(jìn)行貯藏，分別在果實(shí)貯藏0、3、6、9、12和15 d取樣測(cè)定。

1.2 線粒體的制備

隨機(jī)取10枚果實(shí)取果肉50 g，用100 mL提取液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，內(nèi)含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA、0.5% PVP、0.1% 半胱氨酸）在4 ℃研磨，用4層紗布過(guò)濾，濾液在4 ℃下 6 137 r/min離心10 min， 以后的離心和洗滌步驟參照Van Emmerik等[12]的方法，取上清液在4 ℃下11 481 r/min離心分離20 min；將沉淀用20 mL洗滌液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，內(nèi)含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1%BSA）洗滌，4 ℃下11 481 r/min離心分離20 min，再取上清液離心分離，得到的沉淀即為線粒體，用1.5 mL懸浮液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，內(nèi)含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA）懸浮，線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)含量用牛血清蛋白標(biāo)定法測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

采用林植芳等[13]的方法測(cè)定過(guò)氧化氫（H2O2）含量，并依據(jù)王愛國(guó)等[14]的方法測(cè)定超氧陰離子自由基（O2-·）產(chǎn)生速率?？箟难幔ˋsA）和脫氫抗壞血酸（DHAsA）含量測(cè)定參考Arakawa等[15]和Nakagawara等[16]的方法；還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量測(cè)定參考Castillo等[17]的方法；單脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性的測(cè)定參考Shigeoka等[18]的方法，以1 min內(nèi)OD340 nm變化0.01個(gè)單位定義為1個(gè)酶活性單位；谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測(cè)定參考Smith等[19]的方法，以1 min內(nèi)每克鮮樣OD340 nm變化0.01個(gè)單位定義為1個(gè)酶活性單位。以上測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.1 ANOVA過(guò)程作差異顯著性檢驗(yàn)，并用LSD法作多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采收期對(duì)費(fèi)約果貯藏期間線粒體細(xì)胞H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率的影響

從圖1可以看出，3種不同采收期費(fèi)約果果肉線粒體細(xì)胞H2O2含量的變化在貯藏前6 d差異不明顯，均表現(xiàn)為緩慢增加，說(shuō)明費(fèi)約果離開樹體短期內(nèi)H2O2代謝相對(duì)穩(wěn)定；貯藏9 d后，3種采收期果肉線粒體細(xì)胞H2O2含量均出現(xiàn)迅速上升的變化趨勢(shì)，且過(guò)熟期和始熟期采收果實(shí)H2O2含量增加的速率顯著高于盛熟期，說(shuō)明過(guò)早和過(guò)晚采收費(fèi)約果均會(huì)引起果實(shí)貯藏后期H2O2含量的紊亂。

與果肉線粒體細(xì)胞H2O2含量的變化相似，O2-·產(chǎn)生速率在果實(shí)貯藏前6 d也呈緩慢增加的過(guò)程，且3種不同采收期果實(shí)在貯藏0、3和6 d時(shí)O2-·產(chǎn)生速率均無(wú)顯著差異（圖2）。貯藏第9天，盛熟期采收的果實(shí)O2-·產(chǎn)生速率為0.20 μmol/（min·mg protein），并顯著高于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)；而貯藏最后6 d，過(guò)熟期采收的果實(shí)O2-·產(chǎn)生速率顯著高于始熟期和盛熟期采收的果實(shí)，說(shuō)明過(guò)熟期采收的果實(shí)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期貯藏可能會(huì)引起O2-·代謝紊亂，導(dǎo)致費(fèi)約果腐爛，失去商品價(jià)值。

2.2 采收期對(duì)費(fèi)約果貯藏期間線粒體細(xì)胞AsA-GSH循環(huán)酶活性的影響

圖3反映了不同采收期對(duì)費(fèi)約果貯藏期間果肉線粒體細(xì)胞APX活性的影響。果實(shí)采收時(shí)，3種采收期采收的果實(shí)APX活性差異不顯著。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，過(guò)熟期采收的果實(shí)APX活性變化比較平緩，至貯藏結(jié)束時(shí)APX較采收時(shí)僅僅增加了0.76 U/mg protein，而盛熟期和始熟期采收的果實(shí)APX活性在貯藏前9 d變化相對(duì)緩慢，9 d后呈迅速增加的變化趨勢(shì)，至貯藏結(jié)束時(shí)APX活性較采收時(shí)分別增加了3.49和1.46 U/mg protein。

從圖4可以看出，不同采收期采收的費(fèi)約果果肉線粒體細(xì)胞GR活性在整個(gè)貯藏過(guò)程中均呈上升的變化趨勢(shì)。過(guò)熟期采收的果實(shí)GR活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)增加速率明顯高于始熟期和盛熟期采收的果實(shí)，至貯藏結(jié)束時(shí)其活性達(dá)到了5.39 U/mg protein，相當(dāng)于采收時(shí)的8.90倍；始熟期采收的果實(shí)在前9 d變化較小，之后3 d活性變化最大，至貯藏結(jié)束時(shí)活性較采收時(shí)增加了2.84 U/mg protein；盛熟期采收的果實(shí)GR活性在整個(gè)貯藏期間變化比較平緩，未出現(xiàn)急劇變化過(guò)程。

由圖5可見，不同采收期采收的費(fèi)約果果肉線粒體細(xì)胞DHAR活性在貯藏前6 d基本沒有變化，6～12 d不斷增加，之后迅速下降。始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)DHAR活性變化趨勢(shì)一致，在貯藏12 d時(shí)出現(xiàn)最大值，活性分別為3.02和2.77 U/mg protein，顯著高于其他貯藏期；除貯藏第9天外，盛熟期采收的果實(shí)DHAR活性在整個(gè)貯藏過(guò)程中均顯著低于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)。

2.3 采收期對(duì)費(fèi)約果貯藏期間線粒體細(xì)胞抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響

不同采收期費(fèi)約果在貯藏過(guò)程中果肉線粒體AsA和DHAsA含量及比值的變化見表1。從表1可以看出，始熟期采收的果實(shí)果肉線粒體AsA含量在果實(shí)采收時(shí)（貯藏0 d）極顯著高于盛熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)。在貯藏前6 d，始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)果肉線粒體AsA和DHAsA含量均呈上升趨勢(shì)，而在貯藏第9 d，AsA含量出現(xiàn)了下降，之后又持續(xù)上升直至貯藏15 d出現(xiàn)最大值，其最大含量分別為1.49和1.93 μmol/mg protein；除貯藏9 d外，盛熟期采收的果實(shí)AsA和DHAsA含量在整個(gè)貯藏過(guò)程中均低于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)，最大值也出現(xiàn)在貯藏末期（15 d），其含量為1.05 μmol/mg protein。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3種不同時(shí)期采收的果實(shí)AsA與DHAsA的比值均逐漸下降，至貯藏結(jié)束時(shí)，盛熟期采收的果實(shí)果肉線粒體AsA/DHAsA值明顯高于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)，說(shuō)明盛熟期采收的果實(shí)在貯藏期間能更好地維持AsA和DHAsA的平衡。

從表2可以看出，不同采收期果實(shí)在采收時(shí)果肉線粒體GSH含量差異較大，其中盛熟期果實(shí)采收時(shí)GSH含量最低，相當(dāng)于始熟期和過(guò)熟期采收果實(shí)的64.87%和74.48%，而在整個(gè)貯藏過(guò)程中，除貯藏9 d外，盛熟期采收果實(shí)的GSH含量也均極顯著低于另兩個(gè)時(shí)期采收的果實(shí)；從表2還可以看出，3種時(shí)期采收的果實(shí)GSH和GSSG含量總體均呈上升趨勢(shì)，其中貯藏前6 d，GSH含量變化平緩，而貯藏6 d后果實(shí)GSH和GSSG含量變化比較迅速，尤其是始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)，至貯藏末期GSH含量分別是采收時(shí)的2.90和4.54倍；另外，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，GSH/GSSG值也呈不斷下降的趨勢(shì)，至貯藏末期3種采收期下的果實(shí)果肉線粒體GSH/GSSG值分別為采收時(shí)的46.62%、72.18%和42.25%。

3 小結(jié)與討論

果實(shí)在貯藏過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的積累會(huì)不斷增加而使膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用加強(qiáng)，破壞機(jī)體組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致果實(shí)腐爛[20]。適宜的采收期對(duì)維持果實(shí)商品性和貨架期至關(guān)重要，果實(shí)貯藏期間，胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的H2O2，在正常情況下可通過(guò)Halliwell-Asada途徑清除，果實(shí)采收過(guò)早或過(guò)晚均會(huì)影響 Halliwell-Asada途徑中關(guān)鍵酶（APX、GR以及DHAR等）和底物（AsA和GSH）的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而破壞活性氧代謝平衡[21]。試驗(yàn)中對(duì)費(fèi)約果分3個(gè)成熟期進(jìn)行采收，結(jié)果顯示，不同采收期果肉線粒體細(xì)胞H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率在貯藏前6 d變化不顯著，說(shuō)明采收期在費(fèi)約果短期貯藏期間對(duì)活性氧代謝影響不大；但是果實(shí)貯藏9 d后，果肉線粒體細(xì)胞H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率均出現(xiàn)迅速上升的變化趨勢(shì)，且過(guò)熟期和始熟期采收果實(shí)上升的速率極顯著高于盛熟期，說(shuō)明過(guò)早和過(guò)晚采收費(fèi)約果均可能會(huì)引起果實(shí)貯藏后期活性氧代謝的紊亂，不利于長(zhǎng)期貯藏。

在AsA-GSH循環(huán)中，DHAR、APX以及GR在AsA和GSH參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用，其中DHAR可以催化AsA的再生，試驗(yàn)中DHAR活性在果實(shí)貯藏前12 d不斷增加，這可能是為適應(yīng)體內(nèi)活性氧積累的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)，有利于AsA的再生。過(guò)熟期和始熟期采收果實(shí)在貯藏期間DHAR活性均極顯著高于盛熟期采收的果實(shí)，一方面可能與過(guò)熟期和始熟期果實(shí)采收時(shí)DHAR活性較高有關(guān)，另一方面可能是由于這兩個(gè)時(shí)期采收的果實(shí)貯藏期間活性氧產(chǎn)生速率過(guò)高，刺激了DHAR活性；大量研究表明，APX活性直接影響到AsA的含量，在AsA-GSH 循環(huán)代謝中，APX被認(rèn)為是植物細(xì)胞中有效分解H2O2的重要酶之一，APX 活性的增加有助于果實(shí)耐貯性的提高[22]，試驗(yàn)結(jié)果顯示，盛熟期采收的果實(shí)果肉線粒體細(xì)胞APX活性在貯藏后期迅速增加，其活性增加速率極顯著高于始熟期和過(guò)熟期，由此可推測(cè)盛果期采收的費(fèi)約果果實(shí)較始熟期和過(guò)熟期更耐貯藏。

GR是普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的抗氧化誘導(dǎo)酶，對(duì)清除活性氧起積極作用，當(dāng)活性氧的含量危及到GR的活性時(shí)，植物就會(huì)受到傷害。試驗(yàn)結(jié)果表明，果實(shí)在貯藏前期GR的活性比較穩(wěn)定，而貯藏后期迅速增加，筆者認(rèn)為貯藏后期酶活性的增加可能是受到了活性氧的誘導(dǎo)，AsA-GSH循環(huán)做出了適應(yīng)性反應(yīng)以提高活性氧清除效率；同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果還顯示，過(guò)熟期采收的果實(shí)GR活性在貯藏后期增長(zhǎng)速率顯著高于始熟期和盛熟期采收的果實(shí)，說(shuō)明過(guò)熟期采收的果實(shí)在貯藏后期受活性氧破壞的程度更嚴(yán)重，不利于中長(zhǎng)期貯藏；另一方面，果實(shí)在貯藏過(guò)程中，GR可以誘發(fā)增加抗氧化劑的合成，如AsA、GSH等，從而限制脂類過(guò)氧化，因此通過(guò)提高GR的活性可能會(huì)增加GSH的積累，試驗(yàn)中GSH的含量變化與GR活性的變化達(dá)到極顯著正相關(guān)（r=0.944 1，P=0.01），也證實(shí)了以上觀點(diǎn)。

植物AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的AsA/DHAsA、GSH/GSSG比率反映了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原勢(shì)，而細(xì)胞內(nèi)的氧化還原勢(shì)決定體內(nèi)電子流，電子流又在體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面占重要地位，調(diào)控ASA、GSH參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Ziegler[23]認(rèn)為較高的AsA/DHAsA和GSH/GSSG比率對(duì)維持氧化-還原反應(yīng)順利進(jìn)行和AsA在氧化脅迫下再生很有必要。試驗(yàn)結(jié)果表明，費(fèi)約果貯藏過(guò)程中果肉線粒體細(xì)胞AsA/DHAsA和GSH/GSSG的比率均處于下降的趨勢(shì)，至貯藏結(jié)束時(shí)，盛熟期采收的果實(shí)果肉線粒體AsA/DHAsA以及GSH/GSSG值顯著高于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)，說(shuō)明費(fèi)約果果實(shí)在盛熟期采收有助于維持AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的平衡，促進(jìn)AsA再生，但本試驗(yàn)中始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)AsA含量在貯藏期間反而高于盛熟期采收的果實(shí)，可能是由于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)在貯藏期間活性氧的大量積累刺激了AsA合成，使機(jī)體組織中AsA和DHAsA總量得到了增加，其合成機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

從費(fèi)約果果實(shí)貯藏期間果肉線粒體細(xì)胞活性氧代謝來(lái)看，盛果期（花后150 d左右）采收有利于維持果實(shí)貯藏期間活性氧代謝平衡，而采收過(guò)早或過(guò)晚活性氧產(chǎn)生速率均明顯提高，不利于果實(shí)中長(zhǎng)期貯藏；同時(shí)，盛熟期采收的果實(shí)果肉線粒體細(xì)胞中在維持AsA-GHS循環(huán)平衡方面也顯著高于始熟期和過(guò)熟期采收的果實(shí)，保證了Halliwell-Asada途徑在清除活性氧方面底物和關(guān)鍵酶高效運(yùn)轉(zhuǎn)，有利于果實(shí)中長(zhǎng)期貯藏。

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