杜瑞平　郭　帥　潘　娜　修　磊　王麗思

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；3.包頭市固陽縣農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，包頭 014200)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是公認(rèn)的綠色安全(generally regarded as safe，GRAS)級微生物，其在人體、動物、植物和整個(gè)自然界中廣泛分布[1]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌主要通過在機(jī)體腸道內(nèi)定植來改善腸道微生態(tài)環(huán)境，并具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等生理功效[2]。目前的研究表明乳酸菌的上述功能可能與其次生代謝產(chǎn)物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)有關(guān)。自然界中產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌很多，目前研究的大多數(shù)菌株是從乳及乳制品、傳統(tǒng)的發(fā)酵食品、動物腸道中分離獲得的。近些年來，由于消費(fèi)者的需求重點(diǎn)向天然無殘留的安全健康的食品轉(zhuǎn)移，所以乳酸菌胞外多糖的性質(zhì)和生理功能受到越來越多的重視。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，乳酸菌胞外多糖已可以應(yīng)用于酸奶、干酪乳等食品中，并作為益生元加以利用[3]。同時(shí)，乳酸菌胞外多糖還作為天然添加劑應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、畜牧業(yè)等領(lǐng)域[4]。本文重點(diǎn)介紹了近些年來乳酸菌胞外多糖的益生功能及其作用機(jī)制研究進(jìn)展，并對其在動物營養(yǎng)中的研究進(jìn)展作一概述。

1　乳酸菌胞外多糖簡介

多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，廣泛分布于動植物、真菌、藻類和細(xì)菌中，根據(jù)來源不同可分為動物多糖、植物多糖和微生物多糖(真菌多糖、藻類多糖和細(xì)菌多糖)。微生物多糖的存在形式主要包括構(gòu)成微生物細(xì)胞成分的胞內(nèi)多糖、黏附在細(xì)胞表面作為維持細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)性多糖以及分泌到培養(yǎng)基中的胞外多糖[5]。作為細(xì)菌多糖目前的主要研究對象，乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中合成并分泌于細(xì)胞外或滲入培養(yǎng)基中的多糖及其混合物，可以分為莢膜多糖和黏液多糖[6-7]，又可以分為同多糖(homopolysaccharide，HoPS)和雜多糖(heteropolysaccharide，HePS)[8]。乳酸菌胞外多糖中單糖種類和組成比例受到菌株類型、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。大量研究結(jié)果表明，乳酸菌胞外多糖在幫助微生物抵御脫水、營養(yǎng)缺乏、噬菌體、滲透壓、拮抗物和有毒物質(zhì)等不利條件時(shí)發(fā)揮重要作用[9]，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生理活性[6]。

2　乳酸菌胞外多糖的生理調(diào)節(jié)作用

2.1　免疫調(diào)節(jié)作用

乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)功能主要是通過激活免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)、促進(jìn)單核細(xì)胞吞噬能力和調(diào)控免疫細(xì)胞因子(如補(bǔ)體、白細(xì)胞介素等)的分泌來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[10-11]。Kishimoto等[12]將德氏乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖作用于人的腸上皮Caco-2細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，結(jié)果顯示這2種細(xì)胞均分泌了大量的腫瘤壞死因子α(TNF-α)和多種細(xì)胞因子。Morifuji等[13]研究發(fā)現(xiàn)，給9周齡的小鼠連續(xù)灌胃發(fā)酵乳或者胞外多糖10 d后，將小鼠背部皮膚暴露于紫外線(20 mJ/cm2)中，小鼠背部皮膚無損傷，表明無論是攝入發(fā)酵乳還是胞外多糖都能顯著減弱紫外線所誘導(dǎo)的紅斑形成、皮膚干燥及表皮增殖。分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)從乳酸菌發(fā)酵乳中分離出的胞外多糖增強(qiáng)了DNA的修復(fù)機(jī)制并提高了皮膚的免疫力，因而能夠保護(hù)皮膚免受紫外線損傷。乳酸菌胞外多糖還可分為酸性胞外多糖(APS)和中性胞外多糖(NPS)[14]。Nishimura-Uemura等[15]利用保加利亞乳桿菌OLL1073R-1產(chǎn)生的NPS和APS來培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞J774.1，并以巨噬細(xì)胞形態(tài)以及一氧化氮(NO)、細(xì)胞因子的產(chǎn)量為指標(biāo)，探究乳酸菌胞外多糖引起的巨噬細(xì)胞功能的變化，結(jié)果顯示：在細(xì)胞形態(tài)方面，APS能夠刺激巨噬細(xì)胞激活，而NPS幾乎無刺激作用；NPS和APS均不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO；小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)APS刺激后細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量高于NPS刺激后的表達(dá)量。該試驗(yàn)結(jié)果證明該菌所產(chǎn)APS具有促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能的作用。

乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)作用也可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究顯示，含有磷酸基團(tuán)或者硫酸基團(tuán)的胞外多糖能更有效地誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖、活化或分泌細(xì)胞素類物質(zhì)[16]。Laio等[17]闡述了乳酸菌胞外多糖發(fā)揮免疫功能的一種新分子機(jī)制，研究中以小腸上皮細(xì)胞為模型，探究2種乳酸菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖與宿主細(xì)胞的分子間相互作用，結(jié)果顯示2種乳酸菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖均能降低缺乏Toll樣受體(TLR)細(xì)胞的炎性因子表達(dá)量；已知胞外多糖可以依賴于TLR2、TLR4和TLR信號通路的負(fù)調(diào)控發(fā)揮免疫作用，在此基礎(chǔ)上，該研究還發(fā)現(xiàn)乳酸菌和胞外多糖以RP105/MD1途徑來減少小腸上皮細(xì)胞的炎癥。因此，從目前的研究來看，由于乳酸菌胞外多糖具有菌株特異性，不同菌株產(chǎn)生的胞外多糖種類、結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量等的物化差異性較大，這些差異性直接導(dǎo)致了這些胞外多糖具有不同的特定功能，因此，在對新分離的乳酸菌胞外多糖的功能篩選時(shí)，對其進(jìn)行免疫活性的研究是非常有必要的。

2.2　抗腫瘤功能

能產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌種類有很多，其中能產(chǎn)生具有抗腫瘤作用的胞外多糖所對應(yīng)的乳酸菌目前探明的包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)等20多種[18-19]。目前，研究者們對某些具有抗腫瘤、抗癌活性的乳酸菌胞外多糖展開了研究。Wang等[20]研究了植物乳桿菌70810所產(chǎn)胞外多糖對腫瘤細(xì)胞HepG-2、BGC-823和HT-29的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，胞外多糖對3種腫瘤細(xì)胞均有較高的抑制率[依次為(56.34±1.07)%、(61.57±2.07)%、(88.34±1.97)%]，尤其是對腫瘤細(xì)胞BGC-823和HT-29。所以，植物乳桿菌70810所產(chǎn)的胞外多糖可能適合作為功能食品和天然抗腫瘤藥物。劉鷺等[21]研究了硒化乳酸菌胞外多糖對胃癌SGC7901細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)的影響，結(jié)果顯示，加入胞外多糖后2種癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)動態(tài)下降趨勢。其作用機(jī)制可能與胞外多糖進(jìn)行硒化修飾有關(guān)，即硒化后的胞外多糖與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的減少，由此說明硒化后的胞外多糖可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡。Ismail等[22]提取了植物乳桿菌MTCC 9510的胞外多糖作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由植物乳桿菌MTCC 9510產(chǎn)生的胞外多糖的確對乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用，證明了胞外多糖的確有抗腫瘤作用。Wang等[23]通過噻唑藍(lán)(MTT)法檢測人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長，研究了不同濃度(50、100、200、400和600 μg/mL)和不同時(shí)間(24和72 h)條件下植物乳桿菌YW32產(chǎn)生的胞外多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，胞外多糖的抑制活性具有濃度依賴性，在胞外多糖劑量為600 μg/mL時(shí)具有最高的抑制率(39.24%)。據(jù)Leng等[24]報(bào)道，乳酸菌胞外多糖的抗氧化和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平可能與癌細(xì)胞的生成與轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，高的抗氧化水平可能增強(qiáng)抗腫瘤活性。Wang等[23]推測，來源于植物乳桿菌YW32的胞外多糖的抗腫瘤活性可能與其對羥基和超氧自由基的清除能力有關(guān)，故來源于植物乳桿菌YW32的胞外多糖可以作為天然健康食品用于結(jié)腸癌的治療。此外，還有文獻(xiàn)指出抗腫瘤活性的差異可能與乳酸菌胞外多糖的組成、分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)以及硫酸鹽的含量有關(guān)[25-26]。

目前發(fā)現(xiàn)的乳酸菌胞外多糖抗腫瘤機(jī)制可能為以下幾種：1)通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化能力來間接實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用；2)通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用；3)乳酸菌利用胞外多糖增加在腸腔內(nèi)定植，從而競爭性排斥致癌病原菌在腸腔內(nèi)的黏附。此外，產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌能夠降低腸道內(nèi)細(xì)菌酶、β-葡萄糖醛酸酶等的活性，減少具有致癌作用的次級膽酸量，降低患癌的風(fēng)險(xiǎn)[27]。

2.3　抗氧化功能

對于胞外多糖的抗氧化機(jī)制，目前還沒有確定的結(jié)論，可能的機(jī)制包括：1)多糖分子直接作用于自由基本身，或結(jié)合分解成對機(jī)體無害的產(chǎn)物，或發(fā)生氧化反應(yīng)直接清除；2)多糖分子的螯合催化作用，自由基反應(yīng)過程受阻；3)多糖分子通過提高機(jī)體抗氧化酶系活力而發(fā)揮抗氧化作用[31]。此外，還有報(bào)道認(rèn)為分子質(zhì)量可能與多糖的抗氧化活性有關(guān)，分子質(zhì)量越小，抗氧化活性越強(qiáng)[32]。

2.4　對機(jī)體腸道功能的調(diào)節(jié)作用

乳酸菌胞外多糖主要通過改善腸黏膜的黏附、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡以及為腸道供能的方式，對機(jī)體腸道起到一定的調(diào)節(jié)作用，其對腸黏膜的黏附主要依賴黏附素，包括脂磷壁酸、完整肽聚糖、表層蛋白和胞外多糖等[33]，其中胞外多糖起重要作用。乳酸菌胞外多糖對腸道上皮細(xì)胞的黏附作用有助于其在腸道定植、增強(qiáng)乳酸菌與腸道細(xì)胞之間的信號交流、抑制病原菌在腸道的定植和提高機(jī)體免疫力[34]。乳酸菌胞外多糖增強(qiáng)益生菌對腸道的黏附作用主要包括特異性黏附和非特異性黏附2個(gè)途徑。進(jìn)入腸道后，乳酸菌首先依靠非特異性黏附作用在腸道表面定植，但這種黏附作用力不強(qiáng)，具有可逆性，其分泌的胞外多糖可以增強(qiáng)益生菌在腸道的黏附作用。乳酸菌經(jīng)非特異性黏附在腸道局部聚集后，菌體接著會發(fā)揮特異性黏附作用和宿主細(xì)胞進(jìn)行特異性識別與黏附[35]。

Li等[36]研究了兩歧雙歧桿菌WBINO3對小鼠腸道微生物多樣性的影響，結(jié)果顯示，其所產(chǎn)胞外多糖能顯著提高小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌和厭氧菌的數(shù)量，抑制腸細(xì)菌、腸球菌和脆弱類桿菌的增殖，從而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖到達(dá)人體結(jié)腸部位后能夠被腸道菌群分解成短鏈脂肪酸和乳酸鹽。B?ckhed等[37]發(fā)現(xiàn)由乳酸菌胞外多糖分解產(chǎn)生的短鏈脂肪酸能夠?yàn)槿梭w提供10%的能量。另有報(bào)道稱，分子質(zhì)量大(>106u)的乳酸菌胞外多糖能夠抵抗體外模擬的胃液和腸液的降解，并可作為結(jié)腸發(fā)酵的基質(zhì)，為結(jié)腸提供能量[38]。此外，也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖可作為腸道菌群發(fā)酵的碳源，為菌群提供營養(yǎng)[39]。

3　乳酸菌胞外多糖在動物營養(yǎng)中的研究進(jìn)展

相比其他種類的多糖，包括乳酸菌胞外多糖在內(nèi)的細(xì)菌多糖可以通過發(fā)酵生產(chǎn)，并具有生產(chǎn)周期短，不受時(shí)間、空間等條件限制等優(yōu)點(diǎn)而具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用市場[40]。目前黃芪多糖、靈芝多糖等多種多糖添加劑已被廣泛應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，很好地提高了動物機(jī)體的免疫力，增強(qiáng)了抗病力。但目前關(guān)于乳酸菌胞外多糖生理活性的研究仍主要集中于人類、鼠類等試驗(yàn)?zāi)Ｐ突蛘咴隗w外細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行，其動物營養(yǎng)上的研究和應(yīng)用并不多見，少量研究以單胃動物(豬、雞)為主，反芻動物則未見報(bào)道。Chen等[41]研究了羅伊氏乳桿菌胞外多糖對抗仔豬腸毒性大腸桿菌(ETEC)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，該乳桿菌胞外多糖通過減少腸毒性大腸桿菌在小腸內(nèi)的定植黏附來減緩仔豬腹瀉的發(fā)生。Le等[42]通過給斷奶仔豬飼喂羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的小麥發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵谷物并沒有對試驗(yàn)仔豬的腸道形態(tài)、小腸發(fā)酵、生長性能及營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率產(chǎn)生顯著影響，但乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖能刺激后腸發(fā)酵，提高機(jī)體健康水平。路則慶[43]研究了E.cloacaeZ0206富硒多糖(Se-ECZ-EPS)對肉仔雞和斷奶仔豬生長性能、胴體品質(zhì)、免疫功能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸道微生物多樣性的影響，結(jié)果表明Se-ECZ-EPS增強(qiáng)了肉仔雞和仔豬的免疫功能，有效提高了其生長性能。雖然該研究使用的是從肉靈芝中分離得到的屬于陰溝腸桿菌屬細(xì)菌所產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行的試驗(yàn)，但其研究思路和方法值得在乳酸菌胞外多糖上借鑒開展。筆者所在課題組對植物來源高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株進(jìn)行了篩選鑒定和分離純化，已得到多株優(yōu)良菌株，并利用小鼠模型對這些乳酸菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化功能進(jìn)行了充分研究[44]，下一步擬在羔羊和犢牛等幼齡反芻動物上開展應(yīng)用試驗(yàn)，以期為乳酸菌胞外多糖的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

4　小　結(jié)

從近些年來對乳酸菌胞外多糖生理活性功能的研究可知，其有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和益生功能等多種作用。故理論上乳酸菌可應(yīng)用于酸奶等發(fā)酵食品中，達(dá)到改善酸奶流變學(xué)性質(zhì)、質(zhì)地、風(fēng)味、調(diào)節(jié)腸道等作用；也可應(yīng)用于動物飼料添加劑，以代替抗生素使用；還可以用于醫(yī)療和保健等方面，促進(jìn)人類健康。但目前乳酸菌胞外多糖僅僅在乳制品的發(fā)酵與制備方面實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，而在其他方面實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還有諸多困難，其中最大的障礙是乳酸菌胞外多糖的轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)成本高。所以，目前關(guān)于乳酸菌胞外多糖研究的關(guān)鍵是通過現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)手段獲得高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株，實(shí)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖的高產(chǎn)并投入到工業(yè)化生產(chǎn)中。另外，目前乳酸菌胞外多糖的動物試驗(yàn)還停留在人和嚙齒類動物及單胃動物模型上，在反芻動物上基本未見研究報(bào)道，今后可在犢牛、羔羊等幼齡反芻動物上開展研究，進(jìn)一步拓寬乳酸菌胞外多糖在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用，充分發(fā)揮其綠色飼料添加劑的巨大潛力。