曾慶輝　劉　敏　姚玉紅　丁翔飛　史麗莎　李曉凡　張春暖

(河南科技大學動物科技學院，洛陽 471003)

魚類是比較低等的脊椎動物，免疫系統(tǒng)遠不如哺乳動物及禽類完善，其免疫系統(tǒng)可分為體外免疫系統(tǒng)及體內(nèi)免疫系統(tǒng)，皮膚是魚類體外免疫系統(tǒng)的重要組成部分，魚類皮膚上含有大量的黏液細胞、巨噬細胞和各類淋巴細胞以及其他活性物質(zhì)，在魚體表面形成了阻擋病原微生物的保護膜，是抵御病原微生物感染的有效防線[1]。魚類皮膚黏液成分比較復雜，研究發(fā)現(xiàn)魚類皮膚黏液中不僅存在免疫球蛋白[2]，而且還含有多種酶和免疫因子，包括溶菌酶(LYZ)、組織蛋白酶、酯酶、金屬蛋白酶、凝集素、干擾素、鈣調(diào)素、補體、抗菌肽、組蛋白和核糖體蛋白等[3]。近年來，魚類皮膚黏膜免疫應答的分子機制是魚類免疫學研究熱點問題之一，研究魚類皮膚免疫相關(guān)基因在機體免疫中的作用，有助于理解魚類皮膚免疫應答的分子調(diào)控機制，為魚類病害的預防和治療提供科學參考。

乳酸菌具有增強動物機體免疫力、改善胃腸道菌群平衡、抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓和降低膽固醇含量等作用[4]。據(jù)報道，乳酸菌作為免疫增強劑能夠增強巨噬細胞活性、促進動物免疫器官的發(fā)育、提高細胞的吞噬能力，并且少量的乳酸菌持續(xù)刺激能夠誘導產(chǎn)生干擾素、促進細胞分裂、產(chǎn)生抗體及促進細胞免疫等，從而提高體液免疫和細胞免疫水平[5]。但是關(guān)于德氏乳酸菌在魚類皮膚免疫和抗氧化功能方面的相關(guān)報道還不多，因此，本試驗以黃河鯉作為研究對象，在飼料中添加不同水平的德氏乳酸菌進行飼喂，測定皮膚中相關(guān)免疫和抗氧化指標，為德氏乳酸菌在提高魚類免疫上的應用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

德氏乳酸菌購自瑞士的Fluka公司，活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g；黃河鯉購自洛陽市某養(yǎng)殖場，初始體重為(15.0±0.5) g，試驗開始前馴化2周，馴化期間投喂鯉魚商品飼料(購自洛陽禾豐飼料公司)，鯉魚商品飼料粗蛋白質(zhì)含量為33.6%，粗脂肪含量為6.62%，每天投喂3次。

1.2　試驗飼料

以商品飼料作為基礎飼料，基礎飼料以魚粉、豆粕、菜籽粕和棉籽粕為蛋白質(zhì)源，豆油、魚油為脂肪源，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎飼料中分別添加1×105、1×106、1×107和1×108CFU/g的德氏乳酸菌，配制4種試驗飼料。將各種飼料原料充分粉碎后過60目篩，并逐級混合，然后把德氏乳酸菌加入適量的水，和飼料原料充分混合后用絞肉制粒機制成直徑為2 mm的顆粒飼料，并在40 ℃下烘15 h，使飼料水分含量小于10%，保存在-4 ℃冰箱備用。

1.3　飼養(yǎng)管理

馴化結(jié)束后，選取450尾健康、規(guī)格一致的黃河鯉，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復30尾魚。對照組投喂基礎飼料，試驗組投喂德氏乳酸菌添加量分別為1×105、1×106、1×107、1×108CFU/g的試驗飼料，養(yǎng)殖期為8周。每天投喂3次，投喂時間分別為07:00、12:00、17:00，每日的投喂量為魚體重的4%～5%，并根據(jù)實際采食量相應的增加或減少，養(yǎng)殖期間水溫控制在(25.0±0.2) ℃，溶解氧濃度在(6.0±0.2) mg/L，pH 7.2±0.2，總氨氮濃度小于0.2 mg/mL。

表1　基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

每千克預混料中含有Supplied the following per kg of premix：CuSO4·5H2O 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 25 g，ZnSO4·7H2O 22 g，MnSO4·4H2O 7 g，Na2SeO30.04 g，KI 0.026 g，COCl2·6H2O 0.1 g，VA 900 000 IU，VD 200 000 IU，VE 4 500 mg，VK 3 220 mg，VB1320 mg，VB21 090 mg，VB52 000 mg，VB6500 mg，VB121.6 mg，VC 10 000 mg，氯化膽堿 choline chloride 60 000 mg，泛酸 pantothenate 1 000 mg，葉酸 folic acid 165 mg。

1.4　樣品采集與指標測定

1.4.1樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，試驗魚停食24 h，然后用MS-222(濃度為100 mg/L)對魚進行麻醉，用干凈玻片輕輕刮取皮膚黏液，收集5 mL，放入-20 ℃冰箱以備用，然后取其皮膚，將皮膚置于液態(tài)氮中冷凍1 h，然后儲存在-80 ℃冰箱中，以備后續(xù)分析。

1.4.2皮膚黏液中免疫和抗氧化指標的測定

皮膚黏液中LYZ、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)活性，補體3(C3)、補體4(C4)、丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，具體操作步驟詳見說明書。

1.4.3皮膚中抗菌肽基因相對表達量的測定

表2　引物信息

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

原始數(shù)據(jù)先用Excel 2010做簡單的處理，再用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，當各組差異顯著時，用Duncan氏法進行平均值間的多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤來表示，P<0.05表示顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚黏液中免疫指標的影響

由表3可知，與對照組相比，添加德氏乳酸菌的各試驗組皮膚黏液中各免疫指標均有不同程度的升高，其中1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌組的LYZ、AKP活性和C3、C4含量顯著高于對照組(P<0.05)，而1×105和1×108CFU/g乳酸菌組的這些指標與對照組差異不顯著(P>0.05)。皮膚黏液中ACP活性各組之間差異均不顯著(P>0.05)。

2.2　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚黏液中抗氧化指標的影響

由表4可知，1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌組皮膚黏液中SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，而其他各組之間差異不顯著(P>0.05)；1×106CFU/g德氏乳酸菌組皮膚黏液中CAT和GPx活性顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組與對照組并無顯著差異(P>0.05)；1×105、1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌組皮膚黏液中T-AOC顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組與對照組差異不顯著(P>0.05)；在1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌組皮膚黏液中MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，而其他試驗組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.3　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚中抗菌肽基因表達的影響

由圖1可知，各試驗組皮膚中抗菌肽基因Leap-1和Leap-2的相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，且在1×107CFU/g德氏乳酸菌組達到最高。

3　討　論

3.1　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚黏液中免疫指標的影響

魚類的皮膚中含有大量的黏液細胞、巨噬細胞和抗體分泌細胞，與其他活性物質(zhì)組成了抵御病原微生物感染的有效防線[6]。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加不同水平的德氏乳酸菌后，黃河鯉皮膚黏液中LYZ、ACP活性和C3和C4含量隨升高程度不同，但均有升高，這證明黃河鯉的免疫功能有所提高。LYZ是機體內(nèi)重要的免疫因子之一，主要由一些免疫細胞分泌產(chǎn)生，魚類的皮膚黏液中含有多種酶和免疫因子，這些物質(zhì)對魚類免疫反應起到重要作用。乳酸菌作為一種益生菌，能夠促進有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖，一些有益菌比如乳酸菌和雙歧桿菌的細胞壁含有脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖、磷壁酸復合物，它們具有很強的免疫佐劑活性作用，能夠提高魚類的免疫力[7]。潘康成等[8]報道，乳酸菌可提高水產(chǎn)動物免疫識別力，誘導T、B淋巴細胞和巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，通過淋巴細胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)，從而增強機體的非特異性和特異性免疫功能。關(guān)于益生菌提高魚類血液LYZ活性的已有相關(guān)的報道[9-10]，另外皮膚中的補體在魚類皮膚免疫應答過程中也發(fā)揮著重要作用[11]，其中C3、C4在魚體抵抗病原入侵中發(fā)揮著重要作用，C3是所有補體激活途徑的關(guān)鍵因子[12-13]。關(guān)于乳酸菌提高C3、C4含量在黃河鯉的血液上有相關(guān)的研究，但是在皮膚上的研究還未見報道，C3、C4能夠增強免疫功能可能與其激活相關(guān)免疫通路的關(guān)鍵位點的關(guān)鍵基因有關(guān)，具體的分子機制還有待進一步研究。

表3　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚黏液中免疫指標的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示顯著差異(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with different letter superscripts were significantly different (P<0.05). The same as below.

表4　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚黏液中抗氧化指標的影響

3.2　德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚黏液中抗氧化指標的影響

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

Date columns with different letters were significantly different (P<0.05).

圖1德氏乳酸菌對黃河鯉皮膚中Leap-1(A)和Leap-2相對表達量(B)的影響

Fig.1Effects ofLactobacillusdelbrueckiion relative expression levels ofLeap-1 (A) andLeap-2 (B) genes in skin ofCyprinuscarpioHuanghe var.

3.3　德氏乳酸菌對黃河鯉的皮膚中抗菌肽基因表達的影響

抗菌肽基因廣泛存在于魚類中，是魚類先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抵御病原微生物入侵的過程中發(fā)揮著重要作用[18]。本試驗中，添加德氏乳酸菌的各試驗組黃河鯉皮膚中抗菌肽基因Leap-1和Leap-2的相對表達量均較對照組顯著升高，這表明添加德氏乳酸菌提高了黃河鯉的免疫力和抗病力，這可能是由于德氏乳酸菌提高了皮膚黏液中免疫酶的活性，免疫酶在機體的免疫應答反應中起到了重要作用；另外，免疫球蛋白和一些細胞因子可以作為調(diào)節(jié)免疫的重要因素，并且乳酸菌產(chǎn)生的一些短鏈脂肪酸可以促進腸道內(nèi)有益菌比如乳酸菌的增殖，抑制有害菌生長，這與免疫反應的調(diào)節(jié)都密切相關(guān)。關(guān)于乳酸菌提高魚類免疫的研究有相似的報道[19-20]，該研究還得出過高濃度的德氏乳酸菌并不能起到較好的效果，因此，適宜的添加量對德氏乳酸菌的作用效果有直接的影響。

4　結(jié)　論

飼料中添加適量的德氏乳酸菌能夠提高黃河鯉皮膚的免疫功能和抗氧化能力，并能上調(diào)抗菌肽基因的表達。在本試驗條件下，黃河鯉飼料中德氏乳酸菌的最適添加量為1×106～1×107CFU/g。