田　剛　黃琳惠　宋曉華　陳代文　毛湘冰　虞　潔　鄭　萍　何　軍　余　冰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

養(yǎng)豬生產(chǎn)中，許多因素會導(dǎo)致豬體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，如飼料霉菌毒素污染、高溫、病毒感染、斷奶等；當過量自由基在體內(nèi)得不到及時清除而大量蓄積時，體內(nèi)氧化-抗氧化防御系統(tǒng)平衡被打破，引發(fā)機體氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致動物免疫力降低，生產(chǎn)性能下降，產(chǎn)品品質(zhì)變差，甚至出現(xiàn)死亡，帶來嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。因此，尋求能有效保護仔豬免遭氧化應(yīng)激危害的功能性產(chǎn)品是仔豬營養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點之一。殼寡糖(chitooligosaccharides，COS)是由甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖降解獲得的低聚糖，由2～10個氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成[3]。研究表明，COS具有多種生物活性，且相對于殼聚糖，具有分子質(zhì)量小、黏度小、易溶于水、無毒副作用等優(yōu)點[4]。體外試驗已證實COS能降低細胞氧化應(yīng)激[5]。體內(nèi)試驗也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加COS能提高動物的免疫力和生產(chǎn)性能[6-7]，減少仔豬腸道有害菌數(shù)量，降低腹瀉率[8-9]。在肉雞飼糧中添加COS能顯著提高其抗氧化能力[10]。但是，當仔豬遭受刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激時，COS的抗氧化保護效應(yīng)尚不清楚。因此，本研究擬驗證正常飼養(yǎng)條件下，仔豬飼糧添加COS的基礎(chǔ)上，通過一次性腹腔注射10 mg/kg BW敵草快(diquat)建立仔豬氧化應(yīng)激模型，進而研究COS對氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬生長性能、抗氧化功能及空腸養(yǎng)分消化和轉(zhuǎn)運能力的影響，為COS在仔豬飼糧中的合理應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

COS由北京中泰和生物科技有限公司提供，有效含量為10%，載體為麥芽糊精。

Diquat購自Sigma-Aldrich公司(上海)，使用時用滅菌生理鹽水配成10 mg/mL的diquat溶液。

1.2　試驗設(shè)計與試驗動物

采用2×2雙因子試驗設(shè)計，腹腔是否滴注diquat(0、10 mg/kg BW)和飼糧中是否添加COS(0、50 mg/kg)為2個主效應(yīng)，共形成4個組(對照組、COS組、diquat組和COS+diquat組)。選取24日齡、平均體重(7.34±0.09) kg的健康“杜×長×大”斷奶仔豬24頭，根據(jù)體重相近原則隨機分為4個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期28 d。其中COS從試驗第1天開始添加，直至試驗結(jié)束；腹腔注射diquat于試驗第22天進行，不注射diquat試驗豬腹腔注射等量生理鹽水。仔豬全程單籠飼養(yǎng)。

1.3　試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)7～11 kg和11～25 kg仔豬營養(yǎng)需要進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼糧中添加試驗設(shè)計劑量的COS構(gòu)成試驗飼糧。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 8 000 IU，VD3500 IU，VE 12.5 mg，VK32.5 mg，VB11 mg，VB28 mg，VB63 mg，VB1215 μg，葉酸 folic acid 0.25 mg，煙酸 nicotinic acid 17.5 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 12.5 mg。

2)微量元素預(yù)混料為每千克飼糧提供 Trace mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (FeSO4·H2O) 100 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 150 mg，Mn (MnSO4·H2O) 20 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 100 mg，I (KI) 0.3 mg，Se (Na2SeO3) 0.3 mg。

3)營養(yǎng)水平均為計算值。Nutrient levels were all calculated values.

1.4　飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所科研基地進行。室溫保持在26 ℃左右，每天喂料4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，每次以仔豬吃飽后料槽內(nèi)略有余料為度，自由飲水。圈舍每天打掃，注意通風換氣，定期消毒。

1.5　樣品采集與處理

1.5.1糞樣

于試驗第18～21天進行部分收糞，每天每個重復(fù)收150 g左右，加入10%糞便重量的10%稀硫酸，并加2滴甲苯，轉(zhuǎn)入樣品袋混勻，放入4 ℃冷凍保存，最后將每個重復(fù)4 d收集的糞樣經(jīng)充分混合后，65 ℃烘干達恒重后粉碎，過40目篩，于-20 ℃保存待測。

1.5.2血漿

所有仔豬禁食12 h后，于試驗第22和29天早上前腔靜脈采血10 mL，置于加肝素鈉試管中，靜置30 min后3 500 r/min離心15 min，分離血漿，分裝后于-20 ℃保存待測。

1.5.3空腸黏膜

于試驗第29天早上稱重采血后，所有仔豬麻醉后迅速打開腹腔分離空腸，剪截完好無損的空腸中段10 cm左右，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干多余水分，置于冰面上沿縱向剪開，用干凈載玻片輕輕刮取黏膜并分裝于凍存管中，液氮速凍后于-80 ℃保存待測。

1.6　檢測指標與方法

1.6.1生長性能

試驗期間準確記錄每個重復(fù)試驗豬每天的采食量，在試驗第1、22和29天早上試驗豬空腹稱重，計算1～21天和22～28天的平均日增重(average daily gain, ADG)、平均日采食量(average daily feed intake, ADFI)和料重比(feed/gain, F/G)。

1.6.2養(yǎng)分表觀消化率

飼糧及糞便中的干物質(zhì)(DM)、有機物(OM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白質(zhì)(CP)、鈣(Ca)、磷(P)、粗脂肪(EE)含量和總能(TE)的檢測參照張麗英[11]的方法，鹽酸不溶灰分(AIA)含量參照GB/T 23743—2009的灼燒處理法進行測定。飼糧養(yǎng)分消化率的計算公式如下：

式中：F1為飼糧中該養(yǎng)分含量(%)；F2為糞便中該養(yǎng)分含量(%)；A1為飼糧中AIA含量(%)；A2為糞便中AIA含量(%)。

1.6.3血漿氧化還原指標

血漿總抗氧化能力(T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量采用比色法測定。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，詳細操作方法參見試劑盒說明書。

1.6.4空腸黏膜二糖酶活性

空腸黏膜中乳糖酶、蔗糖酶和麥芽糖酶活性的測定參照Cao等[12]的方法，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，詳細操作方法參見試劑盒說明書。

1.6.5空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達量

采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體葡萄糖轉(zhuǎn)運載體2(GLUT2)、鈉/葡萄糖轉(zhuǎn)運載體1(SGLT1)、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體1(SLC7A1)、中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體(NAAT)和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體7(SLC7A7)的mRNA相對表達量。組織中總RNA的提取和質(zhì)量檢測參照Chen等[13]的方法進行。cDNA的合成采用試劑盒(Prime ScriptTMReagent Kit, TaKaRa, 日本)進行，具體操作步驟參照說明書。登陸NCBI獲得目的基因CDS序列，引物用Primer Premier 5.0軟件進行設(shè)計，并在NCBI中進行BLAST比對引物特異性，篩選出特異性好的引物序列送華大基因生物科技有限公司進行合成，引物序列見表2。用實時定量PCR儀(ABI-7900)進行測定，RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa，日本) 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR擴增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s。內(nèi)參基因為β-肌動蛋白(β-actin)，相對熒光定量的計算采用2-ΔΔCt法[14]。

1.7　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。其中，應(yīng)激前仔豬的生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和血漿相關(guān)指標采用t檢驗；應(yīng)激后仔豬的生長性能、血漿和空腸相關(guān)指標均采用雙因素有互作方差分析，以diquat(有、無)、飼糧COS(有、無)及二者的互作為主效應(yīng)，結(jié)合Duncan氏法進行多重比較。所有結(jié)果以平均值和總體標準誤表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有差異趨勢。

表2　基因引物序列

2　結(jié)　果

2.1　COS和氧化應(yīng)激對仔豬生長性能的影響

由表3可知，注射diquat前(試驗第1～21天)，飼糧添加COS對仔豬的ADG和ADFI無顯著影響(P>0.05)，有降低F/G的趨勢(P=0.09)。

注射diquat極顯著降低試驗第22～28天仔豬的ADG和ADFI(P<0.01)，極顯著升高F/G(P<0.01)；飼糧添加COS能顯著抑制氧化應(yīng)激仔豬ADG的下降(P<0.05)，并使ADFI升高7.69%，F(xiàn)/G降低13.69%，但差異均不顯著(P>0.05)。

表3　飼糧添加COS和注射diquat對仔豬生長性能的影響

+表示添加或滴注，-表示未添加或滴注。同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

+ means added or injection; - means without added or no injection. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2　COS對氧化應(yīng)激前仔豬養(yǎng)分消化率的影響

由表4可知，飼糧添加COS極顯著升高氧化應(yīng)激前仔豬對飼糧CP、總能、Ash和P的表觀消化率(P<0.01)，顯著升高對飼糧OM、DM、EE和Ca的表觀消化率(P<0.05)。

表4　飼糧添加COS對注射diquat前仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3　COS和氧化應(yīng)激對仔豬血漿抗氧化能力的影響

由表5可知，注射diquat前，飼糧添加COS極顯著升高仔豬血漿SOD活性(P<0.01)，顯著升高血漿T-AOC(P<0.05)，對血漿CAT和GSH-Px活性及MDA含量無顯著影響(P>0.05)。

注射diquat極顯著降低了血漿CAT活性(P<0.01)；飼糧添加COS顯著升高氧化應(yīng)激仔豬的血漿SOD活性和T-AOC(P<0.05)，有提高血漿GSH-Px活性的趨勢(P=0.07)。

表5　飼糧添加COS和注射diquat對仔豬血漿抗氧化指標的影響

2.4　COS和氧化應(yīng)激對仔豬空腸黏膜二糖酶活性及養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達的影響

由表6可知，注射diquat顯著降低了仔豬空腸黏膜中蔗糖酶、乳糖酶和麥芽糖酶的活性(P<0.05)；飼糧添加COS顯著改善了空腸黏膜蔗糖酶、乳糖酶和麥芽糖酶的活性(P<0.05)，且與diquat組相比，diquat+COS組仔豬的乳糖酶、蔗糖酶和麥芽糖酶活性分別升高24.09%(P>0.05)、30.66%(P<0.05)和20.16%(P>0.05)。飼糧添加COS和注射diquat對仔豬空腸黏膜二糖酶活性無顯著交互作用(P>0.05)。

表6　飼糧添加COS和注射diquat對仔豬空腸黏膜二糖酶活性的影響

由表7可知，注射diquat顯著下調(diào)空腸黏膜GLUT2和SGLT1的mRNA表達量(P<0.05)，而對SLC7A7、NAAT和SLC7A1的mRNA表達量無顯著影響(P>0.05)；添加COS顯著抑制注射diquat誘導(dǎo)的GLUT2和SGLT1 mRNA表達量的下調(diào)(P<0.05)。飼糧添加COS和注射diquat對仔豬空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體的mRNA表達量無顯著交互作用(P>0.05)。

表7　飼糧添加COS和注射diquat對仔豬空腸黏膜養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體mRNA表達的影響

3　討　論

正常飼養(yǎng)條件下，飼糧添加COS對仔豬生長性能的影響已有許多報道。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)，COS能夠顯著提高仔豬的ADG和ADFI，且0.5%的添加量優(yōu)于0.25%。Yang等[9]也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.04%和0.06%的COS可提高斷奶仔豬的ADG和飼料轉(zhuǎn)化率。但Han等[15]研究表明，飼糧添加0.3%和0.4%的COS對斷奶仔豬的ADG無顯著影響，但可改善飼料轉(zhuǎn)化率。本研究也發(fā)現(xiàn)，正常飼養(yǎng)條件下，飼糧添加50 mg/kg COS有降低仔豬F/G的趨勢。飼糧添加COS對仔豬生長性能影響不一致的原因，可能與試驗仔豬所處的生理階段及試驗所用COS產(chǎn)品不同有關(guān)。COS是由2～10個氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，因其組分比例及乙?；潭鹊牟煌?，生物學(xué)效應(yīng)存在差異[16-17]。大量研究表明，飼糧添加COS可改善仔豬的飼料轉(zhuǎn)化效率，可能與其能顯著提高飼糧養(yǎng)分消化率有關(guān)。Liu等[8]研究表明，200 mg/kg COS能夠顯著提高16日齡斷奶仔豬對飼糧總能、DM、CP、EE、Ca和P的吸收。Walsh等[17]在仔豬飼糧中添加250 mg/kg不同分子質(zhì)量的COS，發(fā)現(xiàn)與分子質(zhì)量<1、3～5、10～50和51～100 ku的COS相比，5～10 ku的COS能極顯著提高仔豬對飼糧DM、OM和CP等的表觀消化率。本試驗也發(fā)現(xiàn)，正常飼養(yǎng)條件下，50 mg/kg COS能顯著或極顯著提高仔豬對飼糧CP、總能和OM等的表觀消化率，其原因可能與COS能提高仔豬的抗氧化能力和改善腸黏膜屏障功能有關(guān)。正常飼養(yǎng)條件下，50 mg/kg COS可顯著提高仔豬血漿SOD活性和T-AOC，與龍次民等[10]在妊娠后期母豬和新生仔豬上的報道結(jié)果相一致，即飼糧添加30 mg/kg COS能顯著提高母豬和新生仔豬血液抗氧化酶活性，降低MDA含量。此外，研究也表明，COS能夠改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加腸道絨毛密度和高度，降低隱窩深度，增加腸道內(nèi)吸收面積，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[18]。

在仔豬的生命過程中常常會遭受各種應(yīng)激，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧自由基(ROS)的大量產(chǎn)生，如高溫、炎癥、斷奶、高代謝負擔等[19]。過量的ROS若不能被機體的氧化還原系統(tǒng)有效清除，則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，后者會影響仔豬的健康和生長性能。因此，尋求能有效保護仔豬免遭氧化應(yīng)激危害的功能性產(chǎn)品是仔豬營養(yǎng)研究領(lǐng)域的熱點之一。研究已證明，在腹腔注射diquat誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型條件下，仔豬的ADFI和ADG可分別降低29.74%和40.57%，F(xiàn)/G升高45.35%[20]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，注射diquat極顯著降低試驗第22～28天仔豬的ADG和ADFI，極顯著升高F/G；飼糧添加COS能顯著抑制氧化應(yīng)激仔豬ADG的下降，并使ADFI升高7.69%，F(xiàn)/G降低13.69%，提示COS能有效緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬生長性能降低。

COS對氧化應(yīng)激仔豬的保護效應(yīng)可能是通過增強機體抗氧化功能、保護腸道消化酶活性和養(yǎng)分轉(zhuǎn)運載體而實現(xiàn)的。Sun等[21]體外研究表明，COS對細胞中超氧陰離子有較好的清除效果，與維生素C和SOD相當。也有研究發(fā)現(xiàn)，COS對自由基的清除能力會隨著COS濃度的升高而增強[22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，注射diquat導(dǎo)致血漿CAT活性極顯著下降，飼糧添加COS則顯著改善氧化應(yīng)激仔豬的血漿SOD活性和T-AOC，且有提高血漿GSH-Px活性的趨勢。這表明，飼糧添加COS能在仔豬遭受氧化應(yīng)激時提高血漿中抗氧化酶活性和抗自由基能力，進而緩解遭受的氧化損傷。與此同時，因注射diquat會導(dǎo)致仔豬采食量急劇下降，甚至發(fā)生嘔吐、腹瀉等現(xiàn)象，腸道作為消化吸收的主要器官首先遭受缺血而又最遲得到恢復(fù)，當組織再灌注提供氧，出現(xiàn)爆發(fā)性氧消耗，同時產(chǎn)生大量超氧自由基，導(dǎo)致腸道遭受應(yīng)激損傷進而影響其功能。小腸二糖酶是二糖分解的關(guān)鍵酶，其活性的高低可直接反映腸道對糖類物質(zhì)的消化能力。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，注射diquat后仔豬空腸黏膜二糖酶活性顯著降低，可能與應(yīng)激后仔豬采食量驟降有關(guān)。腸腔中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，主要依賴于上皮細胞刷狀緣和基底膜上不同的載體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。其中，葡萄糖的吸收主要通過位于腸道黏膜上皮細胞的鈉/葡萄糖轉(zhuǎn)運載體(sodium/glucose cotransporter, SGLT)家族和葡萄糖轉(zhuǎn)運載體(glucose transporter, GLUT)家族來完成，SGLT1和GLUT2分別是2個家族的重要成員且分布于腸道黏膜上皮細胞。同樣，氨基酸的吸收轉(zhuǎn)運需要氨基酸轉(zhuǎn)運載體，后者可分為中性、堿性和酸性氨基酸轉(zhuǎn)運載體。李麗娟[23]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可顯著降低仔豬腸道黏膜SGLT1和GLUT2的mRNA表達量。Yin等[24]研究卻發(fā)現(xiàn)，注射diquat誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對仔豬空腸氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC7A1、NAAT和SLC7A7的mRNA表達量無顯著影響。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，注射diquat顯著下調(diào)空腸黏膜GLUT2和SGLT1的mRNA表達量，而SLC7A1、NAAT和SLC7A7的mRNA表達量無顯著變化。COS的添加可有效緩解腸道結(jié)構(gòu)和功能的損傷。Xu等[25]研究表明，添加COS可提高斷奶應(yīng)激仔豬的空腸淀粉酶活性，并呈劑量依賴關(guān)系。Xiao等[26]在大腸桿菌攻毒仔豬飼糧中添加30 mg/kg COS能顯著修復(fù)空腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加絨毛高度，降低隱窩深度。本試驗研究也發(fā)現(xiàn)，50 mg/kg COS能顯著增加氧化應(yīng)激仔豬空腸黏膜二糖酶活性及GLUT2和SGLT1的mRNA表達量，但對氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC7A7、NAAT和SLC7A1的mRNA表達量無顯著影響。綜上分析，COS對應(yīng)激仔豬的保護作用，可能是通過增強機體的抗氧化能力，緩解注射diquat導(dǎo)致的ROS的產(chǎn)生和(或)增強機體對ROS的清除，維護腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進而緩解應(yīng)激對仔豬生長性能的危害。

4　結(jié)　論

① 正常飼養(yǎng)條件下，飼糧添加COS可顯著改善仔豬對飼糧的養(yǎng)分消化率，增強機體的抗氧化能力，有降低F/G的趨勢；

② 氧化應(yīng)激條件下，COS可通過改善機體的抗氧化能力，緩解diquat誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，提高應(yīng)激仔豬的空腸養(yǎng)分消化和轉(zhuǎn)運能力，緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的增重下降。