吳沂旎，吳寧玲，莊曾淵，郝進

近年來研究認為[1]，由于各種原因引起的缺血性眼底病變，與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞 （retina vascular endothelial cell,RVEC）受損及繼發(fā)出現(xiàn)的血管活性因子失衡有關(guān)，保護RVEC免受損傷是防治這類疾病的新途徑。川芎嗪具有活血化瘀、擴張血管、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等作用，已被廣泛應(yīng)用于青光眼[2]、缺血性視神經(jīng)病變[3]、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變[4]等眼病，但因為關(guān)于川芎嗪對RVEC作用的研究甚少，有關(guān)該藥對RVEC的保護作用尚不明確。本文以缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞為對象，觀察了不同濃度川芎嗪對其生長、增殖的影響，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1　藥物與試劑

DMEM培養(yǎng)基（美國 Gibco），牛源內(nèi)皮細胞生長因子（購于中日友好醫(yī)院細胞實驗室），胎牛血清（美國 Gibco），磷酸川芎嗪注射液（規(guī)格：50mg，瑞陽制藥有限公司），谷氨酰胺、雙抗、肝素、MTT（四甲基偶氮唑鹽），牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮原代細胞（購于北京中日友好醫(yī)院細胞庫）。ELX808酶標(biāo)儀 （美國Bio-Tek公司產(chǎn)品）；倒置顯微鏡 （日本Olympus公司）

1.2　實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：將購買的牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(RVECs)原代細胞進行復(fù)蘇，取出內(nèi)皮細胞凍存管迅速置于38℃水浴鍋中，使其快速融化，將細胞懸濁液移入離心管中，離心后并加入DMEM完全培養(yǎng)液[含 200 g/L FBS、100 mg/L內(nèi)皮細胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement,ECGS）、100mg/L肝素以及1 g/L雙抗]，并移入鋪滿明膠的75 ml培養(yǎng)瓶。置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中。第2天待細胞貼壁后換液。細胞生長旺盛，4～5 d可傳代1次，取第7～8代的細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組：實驗分為3組。A.正常細胞對照組：用不含血清、生長因子的DMEM常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。B.缺氧模型組：正常細胞對照組+終濃度1000 μmol/ml CoCl2。C.缺氧+不同濃度川芎嗪組：缺氧模型組+不同濃度的川芎嗪 （0.002、0.02、0.2、2 μg/ml，分別記作川芎嗪 1、2、3、4組）。

1.2.3川芎嗪對RVEC增殖影響的測定：制備第7代牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞懸濁液，調(diào)節(jié)其密度為1×105個/ml，種于 96 孔培養(yǎng)板上，每孔種植 200 μl細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后，將細胞分成6組，每組5個平行孔，每孔200 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。實驗結(jié)束前4 h向每孔加入20 μl MTT，實驗結(jié)束后，小心棄去培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜150 μl，在搖床上震蕩10 min混勻，待藍色結(jié)晶完全溶解后，用自動酶標(biāo)儀（波長492 nm）測定各孔光密度[D(492 nm)]值。該值可間接反映活細胞數(shù)量，用以檢測細胞活性。另設(shè)各組細胞培養(yǎng)48 h后觀察，方法同上。實驗重復(fù)5次。以正常細胞對照組的細胞增殖率為100%，其他各組的細胞增殖率=[該組 D(492 nm)值/正常細胞對照組 D(492 nm)值]×100%。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　細胞形態(tài)的變化

倒置相差顯微鏡觀察，正常細胞傳代4 h開始貼壁生長，融合成片，有的呈放射狀排列，活細胞透亮，呈梭形、多角形或橢圓形，相互之間連接緊密（圖1A）。在缺氧環(huán)境下，細胞數(shù)目明顯減少，細胞間隙增大，可見部分凋亡細胞（圖1B）。川芎嗪注射液作用24 h、48 h后的細胞培養(yǎng)液由橙紅色變成磚紅色，細胞形態(tài)有些變?yōu)槎趟笮?，凋亡細胞?shù)目明顯減少，細胞數(shù)量增多，成片融合，細胞緊密排列，呈典型的鋪路卵石樣結(jié)構(gòu)（圖1C、1D）。

2.2　川芎嗪對細胞生長的影響

圖1　倒置相差顯微鏡觀察各組牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞生長情況。1A.正常細胞傳代4 h開始貼壁生長，有的呈放射狀排列，活細胞透亮，呈梭形，相互之間連接緊密；1B.在缺氧環(huán)境下，細胞數(shù)目明顯減少，細胞間隙增大，可見部分凋亡細胞；1C.川芎嗪注射液作用24 h后細胞形態(tài)有些變?yōu)槎趟笮?，凋亡細胞?shù)目明顯減少，細胞數(shù)量增多，細胞緊密排列；1D.（48h 川芎嗪 0.2μg/ml）基本同 1C。

缺氧模型及藥物組各時間點的光密度值均較正常細胞對照組低（P＜0.01），加入 0.002 μg/ml川芎嗪后未見明顯變化，與缺氧模型組接近（P＞0.05）；當(dāng)濃度增加至0.02、0.2 μg/ml時，細胞的光密度值開始明顯增加，高于缺氧模型組（P＜0.01），以川芎嗪0.2 μg/ml組的數(shù)值最高，但仍低于正常細胞對照組（P＜0.05）；濃度增加至 2 μg/ml時，其光密度值下降，推測該濃度可能出現(xiàn)了藥物毒性作用而抑制細胞增長。各組不同時間點的平均光密度及細胞增值率見表1。

表1　MTT法測定川芎嗪注射液對缺氧狀態(tài)下RVEC增殖的影響（ˉ±s，n=6）

表1　MTT法測定川芎嗪注射液對缺氧狀態(tài)下RVEC增殖的影響（ˉ±s，n=6）

注：*LSD 方法兩兩比較，與正常細胞對照組比較，24h：P（缺氧組）=0.000；P（0.002 組）=0.000；P（0.02組）=0.000；P（0.2組）=0.003；P（2 組）=0.000；48h*P（缺氧組）=0.000；P（0.002 組）=0.000；P（0.02 組）=0.000；P（0.2 組）=0.043；P（2 組）=0.000。#LSD 方法兩兩比較，與缺氧模型組比較，24h：P（0.002組）=0.105；P（0.02組）=0.000；P（0.2組）=0.000；P（2 組）=0.153；48h：P（0.002 組）=0.082；P（0.02 組）=0.000；P（0.2組）=0.000；P（2組）=0.296。 MTT：四甲基偶氮唑鹽;RVEC：視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞

組別　D(492 nm)培養(yǎng)24 h　培養(yǎng)48 h正常細胞對照組缺氧模型組川芎嗪 1 組（0.002μg/ml）川芎嗪 2 組（0.02μg/ml）川芎嗪 3 組（0.20μg/ml）川芎嗪 4 組（2.00μg/ml）0.426±0.114 0.256±0.011*0.282±0.109*#0.364±0.015*#0.410±0.010*#0.264±0.011*#F值P值0.460±0.021 0.274±0.005*0.290±0.007*#0.376±0.008*#0.428±0.019*#0.288±0.019*#142.3 0.000 205.9 0.000

3　討論

視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞受損是引起因各種缺血性眼底病變病理性變化的始動因素。血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成了血管的光滑內(nèi)襯，便于血液流動，并具備復(fù)雜的酶系統(tǒng)，能合成與分泌多種生物活性物質(zhì)，這些血管活血物質(zhì)當(dāng)中，最為經(jīng)典的是一氧化氮（nitric oxide,NO）及內(nèi)皮素-1（endothelin-1,ET-1）。NO 和 ET-1 的變化是反映血管內(nèi)皮細胞損傷最確切、最直接的標(biāo)志[5]。生理情況下ET-1具有強烈收縮血管作用，可導(dǎo)致血流緩慢，促使血栓形成，而NO具有抑制血管內(nèi)皮素分泌，擴張血管及調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖的作用，并能抑制血小板凝集、黏附及抑制白細胞黏附。NO和ET-1協(xié)調(diào)平衡，維持著血管外周阻力和局部血管的舒縮狀態(tài)，調(diào)節(jié)著視網(wǎng)膜的血液循環(huán)。缺氧是許多血管疾病中常見的病理現(xiàn)象，可在多個方面造成血管內(nèi)皮細胞的損傷[6]，導(dǎo)致NO釋放減少和ET-1增加，血管舒縮功能失調(diào)、血小板凝聚，加速血栓形成，促使眼底病變進展。因此，尋找有效保護視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（RVEC）的藥物對于防治缺血性眼底病變具有重要意義。

川芎嗪又名四甲基吡嗪，是中藥川芎的提取物，具有抑制環(huán)核苷酸磷酸二脂酶的活性，可提高血小板中環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）含量，降低血小板表面活性，從而抑制血小板聚集，防止血栓形成，并有輕度的溶解作用[7]。已有研究報道川芎嗪能保護在缺氧環(huán)境下受損的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)其分泌功能和血管舒縮功能，致ET水平明顯下降，NO水平明顯上升[8]，并能使血漿中氧自由基引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物MDA下降，使氧自由基清除劑SOD的活性升高。另有研究表明川芎嗪對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護作用，可減少缺血后視網(wǎng)膜細胞的凋亡[9]，清除氧自由基，對抗視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷所介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，以及有效穩(wěn)定細胞膜、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[10]。而對于川芎嗪是否能促進缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的增殖，國內(nèi)外尚未見報道。

本實驗中，我們采用MTT法檢測缺氧狀態(tài)下不同濃度川芎嗪對RVEC生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎嗪0.02、0.2 μg/ml組的光密度值較缺氧組明顯升高，且后者的數(shù)值更高，提示在一定濃度范圍內(nèi)川芎嗪對缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的RVEC具有促增殖作用，并存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這可能是其保護RVEC及RVEC功能的機制之一。當(dāng)濃度升高至2 μg/ml時測量到的光密度值反而下降，推測可能在此濃度時出現(xiàn)藥物的毒性作用，抑制細胞增長。

本研究結(jié)果顯示，川芎嗪可抑制缺氧引起的RVEC活性降低，對細胞的增殖有一定的促進作用，推測該藥能在一定程度上阻斷內(nèi)皮細胞受損導(dǎo)致的一系列病理變化，進而減輕眼部的病理改變，發(fā)揮對RVEC的保護作用。目前有關(guān)川芎嗪對眼科疾病作用機制的實驗研究不多，對于該藥在RVEC保護作用等方面的深入探索，不僅能為川芎嗪治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞等缺血性眼底病變提供重要的藥理學(xué)依據(jù)，也有助于其在眼科領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。