雷曉琴，李高彪，周云云，李雨薇，任翠翠，艾華

氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的病程中發(fā)揮著極其重要的作用，高血糖或糖尿病(diabetes mellitus，DM)時增強的氧化應(yīng)激反應(yīng)能使視網(wǎng)膜受損[1]。核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件 (antioxidant response element，ARE)信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在氧化應(yīng)激相關(guān)組織損傷中發(fā)揮重要作用[2]。Nrf2轉(zhuǎn)入細(xì)胞核和ARE結(jié)合進(jìn)而調(diào)控血紅素氧合酶1(HO-1)等下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化損傷和抑制視網(wǎng)膜增殖等作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，是目前發(fā)現(xiàn)的促使DR新生血管形成的最主要因子[4-5]。課題組前期研究表明通絡(luò)駐景丸對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變氧化應(yīng)激、炎癥因子的高表達(dá)具有明顯抑制作用[6-7]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以Nrf2/ARE通路為切入點，觀察通絡(luò)駐景丸對DM大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1、VEGF表達(dá)的影響，探討通絡(luò)駐景丸對DM大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及其作用機制。

1　材料與方法

1.1　實驗動物

SPF級SD大鼠，體重(200±20)g，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心清潔級動物房。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，除空白組（NC組）大鼠20只，其余用STZ腹腔注射造成DM動物模型。將STZ按1%濃度溶解于新配檸檬酸緩沖溶液中，按60 mg/kg注射制備DM大鼠，給予NC組大鼠相同體質(zhì)量的上述緩沖液。造模成功的大鼠40只隨機均分為模型組（DM組）、通絡(luò)駐景丸組（TLZJ組）。NC組、DM組給予蒸餾水，TLZJ組給予通絡(luò)駐景丸，按臨床等效劑量的10倍灌胃，1次/日，共12周。

1.2　藥物、試劑和儀器

鏈脲佐菌素（Sigma公司）。通絡(luò)駐景丸（由熟地黃，車前子，菟絲子，墨旱蓮，蒲黃，三七，地龍等組成），4 g/袋，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院提供，實驗時用蒸餾水配置成所需濃度的混懸液；兔抗大鼠Nrf2、HO-1、VEGF 單 克隆抗 體 (CST 公司)；Nrf2、HO-1、VEGF、GAPDH引物序列 (西安熱默爾生物科技有限公司)；提取總RNA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green PCR試劑盒(ABI公司)；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；實時定量PCR儀（Takara公司）。

1.3　大鼠視器組織標(biāo)本制備

將NC組、DM組、TLZJ組大鼠各組均分為2組，分別于成模后6周和12周收集心臟血液備用，同時取大鼠視器，兩時間點分別任取各組10只視器制成石蠟切片標(biāo)本。分別取各組兩時間點剩余視器的視網(wǎng)膜并在PBS中漂洗，立即放于液氮中備用。

1.4　免疫組織化學(xué)法檢測大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、HO-1、VEGF蛋白的表達(dá)量

取3組各時間點的石蠟切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法， 兔抗大鼠 Nrf2(1∶100)、HO-1(1∶100)、VEGF(1∶100)。脫蠟、水化、抗原修復(fù)、漂洗 5 min、PBS洗滌；加一抗，4℃，過夜；PBS 洗滌，加二抗，孵 2 h，PBS洗滌，DAB顯色，流水沖洗；蘇木素染色，流水洗10 min；脫水、透明、封片。光鏡下觀察，并測定單位面積吸光度(IA)。

1.5　RT-PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的表達(dá)量

Nrf2、HO-1、VEGF、引物序列分別為 107 bp、129 bp、182 bp。取各組視網(wǎng)膜。Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA、OligodT、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、5 × Buffer 各 3 μg、1 μL、0.5 μL、1 μL、4 μL，加 DEPC 水至 20 μL；反應(yīng)條件：45℃ 60 min，95℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。擴增反應(yīng)體系：cDNA、上游引物、下游引物、2×SYBR GreenⅠ、2×mix各1 μL、0.5 μL、0.5 μL、1 μL、12.5 μL， 加 DEPC 水至25 μL。 反應(yīng)步驟：94℃ 330 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共32循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，計算Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的相對表達(dá)量。

1.6　統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有計量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示；應(yīng)用單因素方差分析對計量資料進(jìn)行處理，析因方差分析用于不同處理因素和時間對測量指標(biāo)的影響，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1和VEGF蛋白相對表達(dá)量

6 周和 12 周時，DM 組 Nrf2、HO-1、VEGF 表達(dá)量明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000，P＜0.05)，TLZJ 組 Nrf2、HO-1 表達(dá)量高于 DM組，VEGF的表達(dá)量較DM組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 值均為 0.000，P＜0.05)。12周與 6周比較，DM組HO-1表達(dá)量較6周降低，Nrf2、VEGF的表達(dá)量較6周增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000，P＜0.05)；TLZJ組 Nrf2、HO-1 表達(dá)量較 6 周增加，VEGF的表達(dá)量較6周減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為 0.000，P＜0.05)。 見表 1

2.2　各組大鼠視網(wǎng)膜中 Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的相對表達(dá)量

6 周和 12 周時，DM 組 Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的表達(dá)量明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 值均為 0.000，P＜0.05)，TLZJ組 Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)量高于DM組，VEGF mRNA的表達(dá)量較DM組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均為0.000，P＜0.05)。12周與6周比較，DM組HO-1 mRNA表達(dá)量較6周減少，Nrf2、VEGF mRNA的表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均為 0.000，P＜0.05)；TLZJ組Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)量較6周增加，VEGF的表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000，P＜0.05)，見表 2。

3　討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）屬中醫(yī)學(xué)“消渴目病”范疇，中醫(yī)理論認(rèn)為肝腎不足，濕濁瘀血阻絡(luò)是DR的關(guān)鍵病機，通絡(luò)駐景丸是在古方駐景丸的基礎(chǔ)上增加墨旱蓮，蒲黃，三七，砂仁，地龍而創(chuàng)制，具有補益肝腎，滋陰瀉濁，通絡(luò)明目之功，是治療DR的臨床經(jīng)驗方，臨床療效確切[8-10]。DR發(fā)病過程中，體內(nèi)可產(chǎn)生過多的活性氧簇(ROS)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，Nrf2/ARE通路是調(diào)控機體氧化還原反應(yīng)的關(guān)鍵通路，激活時可促使抗氧化蛋白因子表達(dá)增強，減輕氧化應(yīng)激損傷[11-13]。研究表明[14]，DM早期大鼠自身能夠?qū)垢咛黔h(huán)境引發(fā)的ROS增多，20周時，DM大鼠抗氧化應(yīng)激損傷能力受損，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示，6周時，DM 組 Nrf2、HO-1、VEGF表達(dá)較NC組增多；12周時，DM組HO-1的表達(dá)較6周時降低，VEGF的表達(dá)增強。說明DM早期，Nrf2/ARE通路被激活，促使DM大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1表達(dá)增強，可減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)；到12周時，HO-1表達(dá)量降低，說明此時DM大鼠出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷；由于VEGF是視網(wǎng)膜缺血缺氧時產(chǎn)生的促新生血管生成的重要因子[4-5]，12周時VEGF表達(dá)較6周增加，說明隨著氧化應(yīng)激損傷的加重，DM大鼠視網(wǎng)膜組織缺血缺氧和視網(wǎng)膜增殖也在加重。

表1　各組大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、HO-1和VEGF蛋白相對表達(dá)量的比較(xˉ±s,n=10)

表2　各組大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、HO-1和VEGF mRNA相對表達(dá)量的比較(xˉ±s，n=10)

通絡(luò)駐景丸干預(yù)6周時，與DM組相比，大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1表達(dá)增強；12周時，TLZJ組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1表達(dá)較6周時進(jìn)一步增強，說明通絡(luò)駐景丸可有效促使DM大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1的表達(dá)，通絡(luò)駐景丸可通過Nrf2/HO-1途徑增強DM大鼠視網(wǎng)膜抗氧化應(yīng)激損傷能力。

12周和6周相比，TLZJ組大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)較DM組顯著下降，可能與HO-1等抗氧化因子表達(dá)增強，減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷和改善視網(wǎng)膜組織缺血缺氧有關(guān)，說明通絡(luò)駐景丸能有效改善視網(wǎng)膜增殖，可通過Nrf2/HO-1/VEGF途徑發(fā)揮抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用；6周時，TLZJ組VEGF的表達(dá)較NC組增加且有統(tǒng)計學(xué)意義，12周時TLZJ組VEGF的表達(dá)較6周時減少，且和NC組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，說明通絡(luò)駐景丸抑制視網(wǎng)膜增殖作用隨干預(yù)時間的增加在增強。通絡(luò)駐景丸可能是通過促進(jìn)Nrf2入核與ARE結(jié)合，激活Nrf2-ARE信號通路，促使抗氧化基因HO-1的表達(dá)，進(jìn)而降低VEGF表達(dá)，發(fā)揮對DM大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。