趙妗頤,李劍峰,張淑卿,何秋婷

(1.貴州師范學院 喀斯特生境土壤與環(huán)境生物修復研究所，貴州 貴陽 550018；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 3.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

草坪蘑菇圈(fairy ring)又稱仙環(huán)病或仙人圈，是由小傘菌(Lepiotasp.)和馬勃屬(Lycoperdonspp.)等各類擔子菌引起的草坪常見病害之一，病原菌絲體由中間向四周蔓延，并輻射狀生長形成環(huán)狀排列的子實體[1]。蘑菇圈病原的生長代謝會引起草地養(yǎng)分的不平衡分布，甚至造成草坪草植株的早衰或死亡。根據(jù)對草坪草的危害程度，草坪蘑菇圈病原可分為3個類型[2]：1)能造成草坪草死亡或坪用性狀嚴重退化；2)加速周邊草坪草的生長或引起草坪草開花，提前完成生活史；3)對草坪草的生長沒有明顯影響。當觀賞性草坪或?qū)嵱眯圆萜?如高爾夫球場、運動場草坪等)發(fā)生第1或第2種草坪蘑菇圈時，會造成草坪草長勢不均、早衰或死亡，使草坪質(zhì)量下降甚至建坪失敗[2]。

現(xiàn)階段草坪蘑菇圈的防治主要依賴化學藥物的熏蒸或噴施[3]，前者是解決土壤問題最直接、有效的途徑，但其毒性較高、操作繁瑣[4-5]；而后者使用便捷、防治效果顯著，但也存在藥劑污染、毒害人畜及有益昆蟲、破環(huán)草坪微環(huán)境生態(tài)平衡等問題[6]。近年來，生物防治成為草坪病害防控的重點發(fā)展方向，有研究表明利用無致病性的Phialophragraminicola可控制剪股穎(Agrostisstolonifera)全蝕病的蔓延[7]。目前一些草坪真菌病害的生防制劑在草坪有害生物綜合防治中具有良好的應用前景[8-10]，而針對草坪蘑菇圈病害的防治，國內(nèi)外仍以化學藥劑為主，但相關專用生防菌劑并不多見。研究者認為木霉菌能有效拮抗擔子菌類真菌[11-12]。姬承東與李劍峰[13]發(fā)現(xiàn)某些木霉菌及其代謝物對蘑菇圈真菌能產(chǎn)生明顯的抑制作用，且用于制備高效拮抗菌劑具有廣闊的市場潛力，但對有關草坪蘑菇圈生防菌劑的發(fā)酵條件研究鮮有報道。鑒于發(fā)酵工藝參數(shù)是植物促生菌及生防菌劑發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)基礎[14]，并且液態(tài)發(fā)酵的生長速度快、成本低、產(chǎn)量高，而固態(tài)發(fā)酵具有設備構(gòu)造簡單、投資少、能耗低，后處理簡便、污染少，廢棄物排放少的特點[15-16]，本研究以對草坪蘑菇圈原菌有良好拮抗作用的一株黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株CP01為研究對象，對其液態(tài)發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基類型、發(fā)酵培養(yǎng)時間、溫度和初始pH等條件參數(shù)進行比較和分析，以獲得該拮抗菌的最適液態(tài)發(fā)酵條件；同時通過對固態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)物料、外源養(yǎng)分類型、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等條件進行單因素試驗，獲得拮抗菌固態(tài)發(fā)酵的最適條件，為草坪蘑菇圈生防菌劑的研發(fā)奠定工藝參數(shù)和技術(shù)基礎。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1試驗菌種供試拮抗菌CP01由貴州師范學院喀斯特生境土壤與環(huán)境修復研究所提供，其初始菌株從正常廢棄平菇栽培菌包中分離純化獲得，2016年10月以通用引物ITS1/ITS4擴增片段進行ITS序列測定，鑒定為黃曲霉(Aspergillusflavus)。

供試的蘑菇圈病原菌D01采集自貴陽市烏當區(qū)東南部(25°59′31.05″ N,109°°04′08.40″ E)貴州師范學院湖畔的狗牙根草坪蘑菇圈上，發(fā)病樣地海拔1 242 m，屬亞熱帶季風濕潤氣候，年均降水量1 179.8～1 271 mm。經(jīng)通用引物ITS1/ITS4擴增片段進行ITS序列測定，鑒定為肉褐麟小傘菌(Lepiotabrunneo-incarnata)(圖1)。

圖1　拮抗菌CP01與蘑菇圈病原菌D01兩點對峙Fig. 1　Two confrontation of fairy ring antagonistic CP01 and pathogen D01

1.1.2培養(yǎng)基配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)[17]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 7，121 ℃濕熱滅菌20 min。

察氏培養(yǎng)基[18]：NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7，121 ℃濕熱滅菌20 min。

青秸稈粉浸提液培養(yǎng)基(CSE)[19]：料水比為1∶50的青秸稈粉浸提液培養(yǎng)基(CSE 1∶50)，121 ℃濕熱滅菌25 min后避光保存。1∶100 CSE培養(yǎng)基配制時取原液稀釋一倍，使用時各添加甘露醇10.0 g·L-1配制成液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)分為兩種。

PDA培養(yǎng)基Ⅰ：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7，121 ℃濕熱滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基Ⅱ：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂11.5 g，水1 000 mL，pH 7，121 ℃濕熱滅菌20 min。

固體培養(yǎng)物料[20]：培養(yǎng)物料選擇青秸稈粉、去營養(yǎng)化青秸稈[21](即秸稈粉濾渣經(jīng)蒸餾水洗滌2～3遍后80 ℃烘干)[19]、廢棄食用菌栽培基質(zhì)[22](即將正常廢棄食用菌栽培菌袋內(nèi)的發(fā)酵物料捏碎、混勻，80 ℃烘箱12 h烘干，以下簡稱基質(zhì))。

固體培養(yǎng)物料的外源養(yǎng)分設置為馬鈴薯培養(yǎng)液、CSE 1∶50與CSE 1∶100青秸稈粉浸提培養(yǎng)液、空白培養(yǎng)液。馬鈴薯、CSE 1∶50與CSE 1∶100青秸稈粉浸提培養(yǎng)液、甘露醇的添加量各為培養(yǎng)基總質(zhì)量的1%，固體培養(yǎng)物料的初始水含量為35%。土豆、CSE浸提液提供氮素、磷素、微量元素，甘露醇提供碳源物質(zhì)。

馬鈴薯培養(yǎng)液：將0.73 g去皮馬鈴薯加入到40 mL蒸餾水中煮沸5～10 min，用紗布過濾后定容至40 mL，再加入0.73 g甘露醇充分攪拌均勻。

CSE 1∶50青秸稈粉浸提培養(yǎng)液：在40 mL蒸餾水中加入0.75 mL CSE 1∶50原液，再加入0.75 g甘露醇(配置CSE 1∶100青秸稈粉浸提培養(yǎng)液與此相同)。

空白培養(yǎng)液：在40 mL蒸餾水中加入0.74 g甘露醇。

根據(jù)試驗設計在每稱取的10 g培養(yǎng)物料中加入5.5 mL馬鈴薯培養(yǎng)液或5.3 mL CSE 1∶50、CSE 1∶100青秸稈粉浸提培養(yǎng)液或5.4 mL空白培養(yǎng)液，混合均勻后制成初始含水量為35%的固體培養(yǎng)物料，并將各培養(yǎng)物料裝入錐形瓶內(nèi)121 ℃濕熱滅菌1 h。

1.2　液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化設計

1.2.1液態(tài)搖瓶發(fā)酵單因素試驗拮抗菌黃曲霉液態(tài)發(fā)酵采用250 mL錐形瓶，每瓶裝液量為100 mL培養(yǎng)基，接種量為一個直徑0.4 cm的菌餅，150 r·min-1搖床震蕩培養(yǎng)，并設置不同的培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間/d、溫度/℃、初始pH 4個指標進行單因素試驗[23-24]。以發(fā)酵產(chǎn)物的菌絲體干重、發(fā)酵液活菌數(shù)、活菌抑菌效果為指標，確定拮抗菌黃曲霉菌株的最佳液態(tài)發(fā)酵條件。

單因素試驗設置：在溫度為28 ℃下培養(yǎng)4 d，設置初始pH為7的不同發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、青秸稈粉浸提液1∶50及1∶100培養(yǎng)基)；保持培養(yǎng)溫度為28 ℃、初始pH為7的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，控制不同的培養(yǎng)時間(3、4、5、6 d)；保持培養(yǎng)時間為4 d、初始pH為7的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，控制不同的培養(yǎng)溫度(18、20、23、25、28、30 ℃)；保持培養(yǎng)時間為4 d、培養(yǎng)溫度為28 ℃，設置馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基不同初始pH(5、6、7、8、9)。試驗均采用1 mol·L-1的HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH，每個處理設3個重復。

1.2.2發(fā)酵液活菌數(shù)及菌絲球干重的測定用無菌紗布過濾發(fā)酵物，獲得發(fā)酵液和菌絲球，再用蒸餾水洗滌菌絲球兩次后烘干稱其干重。將發(fā)酵液稀釋至10-2、10-3、10-4倍，取0.2 mL稀釋液用平板計數(shù)法測其每毫升菌液含菌量(CFU·mL-1)，每個濃度梯度設3個重復。

每毫升菌液含菌量(CFU)= 同一稀釋度3次重復的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。

1.2.3發(fā)酵液特性的檢測根據(jù)牛津杯法測發(fā)酵液抑菌活性[18,25]。即在內(nèi)徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中加入已滅菌的PDA培養(yǎng)基Ⅰ 15 mL，搖勻，置于水平位置使其凝固，作為底層，另取5 mL無菌離心管分別加入0.2 mL病原指示菌(即發(fā)酵4 d的蘑菇圈病原D01發(fā)酵液)和3.8 mL冷卻至48～50 ℃的PDA培養(yǎng)基Ⅱ，迅速搖勻后加入到已凝固的培養(yǎng)基Ⅰ平板中，使其在頂層均勻分布，凝固后分別在每個雙層平板中呈三角位置放置3個無菌牛津杯備用。測發(fā)酵液抑菌活性時分別在3個牛津杯中加入0.2 mL拮抗菌活菌發(fā)酵液，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后移去牛津杯，精確測量各菌落的直徑。

1.3　固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化設計

1.3.1固態(tài)發(fā)酵單因素試驗以測拮抗菌黃曲霉菌株發(fā)酵產(chǎn)物的活菌數(shù)為指標，分別對不同培養(yǎng)物料與外源養(yǎng)分的組合類型、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度進行單因素試驗，從而確定拮抗菌最佳固態(tài)發(fā)酵條件。在選擇培養(yǎng)物料類型及外源養(yǎng)分種類時試驗設置6個處理，即在基質(zhì)與去營養(yǎng)化青秸稈粉內(nèi)分別添加馬鈴薯培養(yǎng)液、CSE 1∶50、CSE 1:100青秸稈粉浸提培養(yǎng)液，以添加空白培養(yǎng)液的無菌物料為對照，并以添加空白培養(yǎng)液的青秸稈粉作為待選物料，28 ℃恒溫培養(yǎng)拮抗菌黃曲霉7 d后測其活菌含量；在培養(yǎng)溫度為28 ℃、固體培養(yǎng)物料為基質(zhì)與CSE 1:50的組合中，控制拮抗菌的培養(yǎng)時間設置為5、6、7、8、9 d；在固體培養(yǎng)物料為基質(zhì)與CSE 1∶50的組合中培養(yǎng)拮抗菌7 d，控制拮抗菌的培養(yǎng)溫度設置為25、27、30、33、35 ℃。每個處理設3個重復。

1.3.2活菌含量的測定將發(fā)酵后的培養(yǎng)產(chǎn)物混勻后稱取0.2 g加入1.8 mL無菌磷酸緩沖液(PBS)，旋渦振蕩器振蕩20 s，洗滌培養(yǎng)物，回收洗滌液，并稀釋洗滌液，用平板菌落計數(shù)法測量其活菌含量(CFU·g-1)。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

以Excel 2003軟件整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行單因素統(tǒng)計分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1　液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1不同發(fā)酵條件對拮抗菌發(fā)酵液菌絲體干重的影響在PDB培養(yǎng)基中，拮抗菌發(fā)酵液中菌絲體干重達到最大值，為10.78×10-3g·mL-1，察氏培養(yǎng)基次之，CSE培養(yǎng)基最低(圖2)。且察氏培養(yǎng)基、CSE 1∶50培養(yǎng)基和CSE 1∶100培養(yǎng)基分別為PDB培養(yǎng)液的28.59%、18.09%和9.97%。PDB培養(yǎng)基與察氏培養(yǎng)基和CSE培養(yǎng)基均差異顯著 (P<0.05)。

圖2　不同培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基初始pH對菌絲球干重的影響Fig. 2　Influences of medium type, fermentation time, fermentation temperature, and initial medium pH on dry weight of mycelial bead

不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。PDB,馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基;CS,察氏培養(yǎng)基;CSE 1∶50、CSE 1∶100，料水比為1∶50和1∶100的青秸稈粉浸提液培養(yǎng)基。下同。

Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level；PDB, potato dextrose broth. CS, Czapek’s solution. CSE 1∶50 and CSE 1∶100, extraction medium of corn stalk leach liquor with material to water ratio of 1∶50 and 1∶100, respectively. similarly for following figures.

拮抗菌培養(yǎng)4 d時菌絲體干重顯著低于培養(yǎng)3、5和6 d (P<0.05) (圖2)。在培養(yǎng)5 d時拮抗菌發(fā)酵液中菌絲體干重達到最大值，為10.54×10-3g·mL-1，分別是培養(yǎng)3、4和6 d的109.92%、126.90%和104.98%。并且在培養(yǎng)6 d時拮抗菌發(fā)酵液中菌絲體干重較5 d的少，與培養(yǎng)3 和5 d的差異不顯著(P>0.05)。

隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵液中菌絲體干重呈逐漸上升趨勢(圖2)。以培養(yǎng)溫度為橫坐標(x)、菌絲球干重為縱坐標(y)進行相關性分析，得到回歸方程為y=3.164 4 ln(x)+4.276 5，相關系數(shù)R2=0.965 3。并在30 ℃時拮抗菌發(fā)酵液中菌絲體干重達到最高值，為9.61×10-3g·mL-1，但與培養(yǎng)溫度為23、25和28 ℃時菌絲體干重差異不顯著(P>0.05)。而培養(yǎng)溫度為18 ℃時，拮抗菌發(fā)酵液中菌絲體干重降到最小值為4.09×10-3g·mL-1，分別為20、23、25、28和30 ℃的 64.81%、48.93%、45.09%、45.11%和42.52%。

拮抗菌在培養(yǎng)基初始pH為6時，發(fā)酵液中菌絲體干重達到最大值，為9.63×10-3g·mL-1，但在該pH下與培養(yǎng)基初始pH為5和7時均差異不顯著(P>0.05)(圖2)。以培養(yǎng)基初始pH為橫坐標(x)、菌絲球干重為縱坐標(y)進行相關性分析，得到回歸方程為y=-0.105 2x2+0.219 1x+9.309 4，相關系數(shù)R2=0.914 7。在培養(yǎng)基初始pH為7、8、9時，其發(fā)酵液菌絲體干重之間差異并不顯著，且隨著培養(yǎng)基初始pH升高而降低。

2.1.2不同發(fā)酵條件對拮抗菌發(fā)酵液活菌數(shù)的影響拮抗菌在CSE培養(yǎng)基中的活菌數(shù)最多，PDB培養(yǎng)基次之、察氏培養(yǎng)基最低(圖3)。即在CSE 1∶50培養(yǎng)基中活菌數(shù)為3.52×106CFU·mL-1，分別為PDB培養(yǎng)基與察氏培養(yǎng)基的22.71和1 760.5倍，且差異顯著(P<0.05)。而在CSE 1∶100培養(yǎng)基中活菌數(shù)為5.76×105CFU·mL-1，分別為PDB培養(yǎng)液與察氏培養(yǎng)基的3.77和288倍 。并且以PDB為拮抗菌培養(yǎng)基時，其發(fā)酵液中的活菌數(shù)分別與察氏培養(yǎng)基和CSE 1∶100培養(yǎng)基差異不顯著(P>0.05)，但察氏培養(yǎng)基與CSE培養(yǎng)基差異顯著(P<0.05)，分別為CSE 1∶50培養(yǎng)基的0.06%、CSE 1∶100培養(yǎng)基的0.35%。

在培養(yǎng)5 d時，拮抗菌發(fā)酵液中活菌數(shù)最高，為3.04×105CFU·mL-1，與培養(yǎng)3、4、6 d的差異均顯著(P<0.05)。但培養(yǎng)3、4、6 d后發(fā)酵液活菌數(shù)之間差異不顯著(P>0.05)，分別為培養(yǎng)5 d的25.91%、24.95%、37.76%(圖3)。

圖3　不同培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響Fig. 3　Influences of medium type, fermentation time, fermentation temperature, and initial medium pH on number of living bacteria in fermented liquid

在培養(yǎng)溫度為30 ℃時，拮抗菌發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為4.74×105CFU·mL-1(圖3)；在培養(yǎng)溫度為18 ℃時，活菌數(shù)最低，為14.2 CFU·mL-1。并且在培養(yǎng)溫度為28 ℃時，拮抗菌發(fā)酵液中活菌數(shù)與18、20、23、25、30 ℃之間均差異顯著(P<0.05)，為30 ℃培養(yǎng)處理的29.04%。

拮抗菌在培養(yǎng)基初始pH為7時活菌數(shù)最低，為2.75×103CFU·mL-1，而在培養(yǎng)基初始pH為5時拮抗菌發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為pH是7處理的2 157.82%(圖3)。并且發(fā)酵液活菌數(shù)在培養(yǎng)基初始pH為8和9時有上升趨勢，增長率分別為pH是7處理的200%和226.55%。

2.1.3不同發(fā)酵條件對拮抗菌發(fā)酵液活菌抑菌效果的影響拮抗菌發(fā)酵液中活菌抑菌效果最佳的培養(yǎng)基為CSE，在CSE 1∶100和CSE 1∶50培養(yǎng)基上菌落直徑為22.75和20.54 mm，分別為PDB培養(yǎng)液與察氏培養(yǎng)基的1.03、1.09倍及1.17、1.21倍(圖4)。并且PDB、CSE 1∶50、CSE 1∶100培養(yǎng)基分別與察氏培養(yǎng)基活菌抑菌效果差異顯著(P<0.05)，分別為察氏培養(yǎng)基的106.43%、109.20%和120.95%。

培養(yǎng)5 d拮抗菌發(fā)酵液中活菌抑菌效果最佳，菌落直徑為24.86 mm(圖4)。而培養(yǎng)6 d拮抗菌的抑菌效果有減弱趨勢，但與5 d時的差異并不顯著(P>0.05)。且在培養(yǎng)3、5、6 d時發(fā)酵液的活菌抑菌效果與培養(yǎng)4 d時的差異顯著(P<0.05)，分別4 d的114.95%、131.81%和126.67%。

培養(yǎng)溫度為23 ℃時,發(fā)酵液活菌抑菌效果最佳，菌落直徑為27.98 mm，與培養(yǎng)溫度為20、30 ℃時發(fā)酵液活菌抑菌效果差異并不顯著(P>0.05)(圖4)。在培養(yǎng)溫度為18 ℃時，其發(fā)酵液活菌抑菌效果最低，且與20、23、25、28和30 ℃處理下差異顯著(P<0.05)，分別為上述溫度的69.81%、66.87%、70.55%、74.60%和68.61%。

培養(yǎng)基初始pH為5時發(fā)酵液活菌抑菌效果最佳，菌落直徑為25.58 mm，與培養(yǎng)基初始pH為7和9時發(fā)酵液活菌抑菌效果差異不顯著(圖4)。并且在培養(yǎng)基初始pH為6和8時，發(fā)酵液活菌抑菌效果差異顯著，分別為培養(yǎng)基初始pH為5時的61.61%、63.60%。

圖4　不同培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基初始pH對拮抗菌發(fā)酵液活菌抑菌效果的影響Fig. 4　Influences of medium type, fermentation time, fermentation temperature, and initial medium pH on fermented liquid of antagonistic antibacterial effect of living bacteria

2.2　固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1不同發(fā)酵條件下對活菌數(shù)的影響在固態(tài)培養(yǎng)物料為去營養(yǎng)化秸稈粉、外源養(yǎng)分為CSE 1∶50時活菌數(shù)達到最高，為9.84×108CFU·g-1(圖5)；在以廢棄的食用菌栽培基質(zhì)為培養(yǎng)物料時活菌數(shù)達到最高，為3.55×108CFU·g-1，但僅為前者的37.18%；而在以不添加外源養(yǎng)分的青秸稈粉為培養(yǎng)基時拮抗菌活菌數(shù)與培養(yǎng)物料為去營養(yǎng)化秸稈粉、外源養(yǎng)分為CSE 1∶50的組合類型差異顯著(P<0.05)，為后者的15.49%。

圖5　不同培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)的影響Fig. 5　Influences of medium type, fermentation time and fermentation temperature on number of living bacterium

PCM，馬鈴薯培養(yǎng)液； CK，無外源養(yǎng)分；CSP，青秸稈粉；CSAEF，廢棄食用菌栽培基質(zhì)；NSP，去營養(yǎng)化秸稈粉。

PCM, potato culture medium; CK, no exogenous nutrients; CSP, corn stalk powder; CSAEF, cultivated substrate of abandoned edible fungi; NSP, nonnutritive corn stalk powder.

隨著培養(yǎng)時間的延長，固態(tài)培養(yǎng)物料中拮抗菌活菌數(shù)逐漸上升，在培養(yǎng)9 d時活菌數(shù)達到最大，為1.58×107CFU·g-1(圖5)。以培養(yǎng)時間為橫坐標(x)、活菌數(shù)為縱坐標(y)進行相關性分析，得到回歸方程y=16.475x2-60.983x+51.497, 決定系數(shù)R2=0.988 4。在培養(yǎng)5、6、7 d時，拮抗菌的活菌數(shù)差異不顯著，分別為培養(yǎng)9 d的2.60%、2.89%、4.27%。

拮抗菌在25、27、30、33、35 ℃下的活菌數(shù)呈單峰曲線變化，即在培養(yǎng)溫度為33 ℃時活菌數(shù)達到最大值，為1.17×108CFU·g-1，而隨溫度降低和升高拮抗菌活菌數(shù)逐漸降低(圖5)；且在培養(yǎng)溫度為25 ℃時活菌數(shù)降到最低，為1.17×107CFU·g-1。

3　討論

目前，已有研究者將黃曲霉制成的菌懸浮液用于防治蘋小卷葉蛾(Adoxophyesoranabeijingensis)[26]，可見黃曲霉已用作害蟲生防菌劑，但鮮見用于草坪蘑菇圈等真菌病害防治方面的報道。本研究對拮抗菌黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株CP01進行液、固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，可為草坪蘑菇圈生防菌劑的研發(fā)奠定工藝基礎和技術(shù)方向。

CSE培養(yǎng)基中含有大量比例均衡的可溶性氮、磷、糖及微量元素，可為微生物的生長繁殖提供可直接利用的營養(yǎng)[19]，并且用CSE培養(yǎng)基培養(yǎng)拮抗菌時，其發(fā)酵液中具有最大活菌數(shù)和最佳活菌抑菌效果，同時CSE培養(yǎng)基價格低廉，符合生產(chǎn)實際需要[27]；而察氏培養(yǎng)基雖成分精確，但不適合拮抗菌AspergillusflavusCP01的發(fā)酵。綜上所述，CSE培養(yǎng)基可作為拮抗菌黃曲霉菌株液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基，且在今后對其他菌株進行發(fā)酵也可考慮CSE培養(yǎng)基。

本研究在觀察拮抗菌黃曲霉的發(fā)酵過程發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)前期拮抗菌發(fā)酵液中菌體為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液與錐形瓶壁接觸的菌體由白色生長為綠色。在發(fā)酵培養(yǎng)至第5天時，拮抗菌發(fā)酵液中的菌絲球質(zhì)量、活菌數(shù)、活菌抑菌效果達到最高。但在本研究中，拮抗菌培養(yǎng)至第4天時出現(xiàn)了一個生長下降點，這可能是該拮抗菌生長特性所致，而在第6天生長下降則有可能是由養(yǎng)分濃度有關[28]。并且拮抗菌黃曲霉菌株很可能對蘑菇圈病原菌的抑制作用是通過菌絲的快速生長或者產(chǎn)生孢子的方式而進行基質(zhì)競爭抑制[29]。

溫度是影響拮抗菌發(fā)酵的重要因素，賀亮等[30]研究表明高溫高濕是影響真菌生長的重要原因。在本研究中培養(yǎng)溫度為18 ℃時，拮抗菌黃曲霉發(fā)酵液中菌絲球含量顯著低于各個處理；而當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，拮抗菌黃曲霉發(fā)酵液中菌絲球含量與活菌數(shù)達到最大值，此外拮抗菌發(fā)酵液活菌抑菌效果最佳的培養(yǎng)溫度卻為23 ℃，但與培養(yǎng)溫度為20 ℃、30 ℃的發(fā)酵液活菌抑菌效果差異不顯著，所以可將拮抗菌黃曲霉最佳培養(yǎng)溫度確定為30 ℃，并且莊振宏等[31]分析也發(fā)現(xiàn)，在30 ℃時黃曲霉生長最為迅速，這與本研究結(jié)果一致。

拮抗菌在培養(yǎng)基初始pH為5和6時菌絲球含量并不顯著，觀察其拮抗菌發(fā)酵液可發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH越接近中性時，發(fā)酵液中菌絲球體積越小、密度越大。綜合分析可知，拮抗菌黃曲霉在培養(yǎng)基初始pH為5時，拮抗菌發(fā)酵液中菌絲球含量、活菌數(shù)、發(fā)酵液活菌抑菌效果均達到最佳，則可能是弱酸性環(huán)境有利于拮抗菌黃曲霉發(fā)酵。據(jù)報道，黃曲霉毒素B1易被亞硫酸鈉、氫氧化鈉等堿性試劑脫除[32]，因此與本研究結(jié)果基本吻合。

本研究通過單因素篩選拮抗菌固態(tài)發(fā)酵條件得知，培養(yǎng)物料及外源養(yǎng)分種類、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時間是影響拮抗菌活菌數(shù)的重要因素。而快速篩選培養(yǎng)基有效成分及確定各成分之間的優(yōu)化組合是菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件篩選的關鍵步驟[33]，其中，培養(yǎng)物料為去營養(yǎng)化秸稈粉、外源養(yǎng)分為1:50秸稈粉浸提液的培養(yǎng)基組合是獲得拮抗菌最大活菌數(shù)的最佳培養(yǎng)基組合；并且拮抗菌最佳培養(yǎng)溫度為33 ℃，在此溫度條件下，接種的拮抗菌孢子可以迅速萌發(fā)產(chǎn)生大量的菌絲體，進而可以生成大量的孢子；在固態(tài)發(fā)酵時，拮抗菌培養(yǎng)至9 d時可以達到最大的活菌數(shù)，觀察其發(fā)酵過程可以發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)前期時，拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲為白色，隨著培養(yǎng)時間的增加，拮抗菌由白色菌絲生長為綠色孢子。

4　結(jié)論

1)液態(tài)發(fā)酵中最適合拮抗菌黃曲霉菌株CP01生長的最適培養(yǎng)基是青秸稈粉浸提液培養(yǎng)基，目標菌活菌含量與抑菌效果較PDB培養(yǎng)基分別顯著高出2 271%和112.62%，并且拮抗菌最佳的培養(yǎng)時間為5 d、培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)基初始pH為5。

2)固態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)物料為去營養(yǎng)化秸稈粉、外源養(yǎng)分為1∶50秸稈粉浸提液培養(yǎng)液是拮抗菌黃曲霉菌株CP01生長最佳的培養(yǎng)基組合類型，且該拮抗菌最佳的培養(yǎng)溫度為33 ℃、培養(yǎng)時間為9 d。