劉丹 羅睿 陳海麗 夏麗莎 高華霞

摘 要：為進(jìn)一步揭示半夏屬植物珠芽發(fā)育的分子機(jī)理，本文利用Illumina Hiseq平臺(tái)對(duì)滴水珠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得6.68 Gb的數(shù)據(jù)，組裝去冗余后得到66，907個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度為893 bp。將Unigene比對(duì)到Nr、KOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別獲得了34，947、27，886、9，149和27，006個(gè)注釋信息。葉柄、珠芽和塊莖表達(dá)譜測(cè)序分別獲得24.08、24.02和24.06 Mb的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中6，961個(gè)Unigene的表達(dá)量在葉柄、珠芽與塊莖之間同時(shí)存在差異（6，576和4，021個(gè)差異Unigene分別比對(duì)到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得13個(gè)Unigene為PEBP基因家族成員相關(guān)序列，其中4個(gè)為差異表達(dá)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序可用于篩選調(diào)控珠芽發(fā)育的候選基因，PEBP基因家族成員在珠芽發(fā)育調(diào)控中的作用值得進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：滴水珠；珠芽發(fā)育；轉(zhuǎn)錄組；表達(dá)譜；PEBP基因家族

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

滴水珠（Pinellia cordata N. E. Brown）是主要分布于我國(guó)安徽、福建、廣東、廣西、貴州、湖北、湖南等地區(qū)的天南星科植物[1]，具有解毒消腫、散痰止痛等功效[2]。滴水珠的自然繁殖主要通過(guò)在葉柄下部和上部（葉片基部）形成珠芽進(jìn)行。滴水珠及同屬植物半夏的珠芽發(fā)育形態(tài)、解剖學(xué)已經(jīng)報(bào)道[3-4]，其發(fā)育特征除啟動(dòng)位置和后期成熟過(guò)程外與龍舌蘭、臺(tái)閩苣苔、山藥和淡黃花百合等類(lèi)似[5-7]。對(duì)于植物珠芽發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究而言，Wang 等[8]在臺(tái)閩苣苔上發(fā)現(xiàn)GFLO基因與珠芽形成有關(guān)，珠芽形成過(guò)程中該基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)；Abraham-Juarez等[9]研究表明在龍舌蘭中KNOX I基因表達(dá)量隨著珠芽成熟而逐漸增加；Sandoval等[10]發(fā)現(xiàn)在龍舌蘭珠芽形成過(guò)程中MADS1， 2， 4， 6， 7基因均呈現(xiàn)出表達(dá)量減少的相同模式。目前在珠芽發(fā)育的分子基礎(chǔ)上研究報(bào)道少且不同植物珠芽發(fā)育的共同特性尚不明確。此外，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因（PEBP）家族包含F(xiàn)T、MFT和TFL三個(gè)亞家族，其不同家族成員可參與調(diào)節(jié)植物開(kāi)花[11]、馬鈴薯塊莖形成[12]和洋蔥鱗莖形成[13]等有性和無(wú)性生殖發(fā)育過(guò)程。但是，目前尚未見(jiàn)報(bào)道PEBP基因家族成員參與調(diào)節(jié)珠芽發(fā)育。

轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序可用于揭示植物器官發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)基因，如程立寶等[14]發(fā)現(xiàn)了蓮藕根狀莖發(fā)生過(guò)程中的86個(gè)相關(guān)基因。轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序也用于植物珠芽發(fā)育研究：彭斌[15]在山藥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選出23個(gè)可能與珠芽發(fā)生有關(guān)的候選基因；姜福星等[16]在萬(wàn)年青的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)EMB基因、TATA結(jié)合蛋白基因和FKBP蛋白等基因在珠芽的形成過(guò)程中表達(dá)量發(fā)生了明顯變化；葉德等[17]在半夏珠芽和葉柄的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選出了19個(gè)與激素有關(guān)的差異基因，其中玉米素、茉莉酸、脫落酸4種激素合成代謝相關(guān)的基因在珠芽中的表達(dá)量高于莖中，赤霉素相反。但是，不同植物珠芽發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組特征異同的揭示需要更多的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

本研究以滴水珠為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序，分析珠芽發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)譜宏觀差異，并進(jìn)一步分析PEBP家族成員的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究半夏屬植物的珠芽發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

滴水珠采集自浙江溫州，盆栽于實(shí)驗(yàn)室備用。在植物的珠芽發(fā)育初期采集植株，純水沖洗后在冰上進(jìn)行取樣：葉柄（pc1）、珠芽（≤3 mm， pc2）和塊莖（pc3）。取得鮮樣用液氮速凍后，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 總RNA的提取和文庫(kù)的構(gòu)建

CTAB法提取總RNA，DNase I處理去除DNA，然后用磁珠法富集mRNA。富集后mRNA等量分為兩份：一份將三個(gè)組織鮮樣的mRNA等量混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的相關(guān)分析；另一份將各組織mRNA進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)譜分析。向獲得的mRNA中加入打斷試劑使得mRNA片段化，以mRNA片段為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。之后對(duì)cDNA的末端進(jìn)行修復(fù)、并在3'末端加上“A”堿基并連接接頭。之后對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并將PCR產(chǎn)物環(huán)化，最終文庫(kù)構(gòu)建成功。構(gòu)建好的文庫(kù)利用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢，合格后使用Illumina Hi Seq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的加工、組裝和注釋

等量混合mRNA建庫(kù)后測(cè)序得到的raw reads進(jìn)行過(guò)濾處理獲得Clean reads，再利用Trinity軟件[18]對(duì)Clean reads進(jìn)行de novo組裝獲得轉(zhuǎn)錄組序列。之后使用Tgicl軟件[19]對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行處理后獲得Unigene。最后，將所有組裝的Unigene利用BLAST[20]比對(duì)到non redundant protein database （Nr）、the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）、clusters of eukaryotic Orthologous Groups（KOG）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（E<10-5）；利用Blast2GO[21]獲得GO注釋?zhuān)焕肐nterProScan5[22]將Unigene注釋到InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 差異基因的GO注釋和KEGG注釋

單獨(dú)建庫(kù)mRNA（1.2）表達(dá)譜測(cè)序后以de nevo組裝、注釋的轉(zhuǎn)錄組序列為參考并利用FPKM法（Fragments Per kb per Million fragments）計(jì)算各個(gè)樣本Unigene表達(dá)量[23]；利用FDR法[24]來(lái)進(jìn)行差異表達(dá)的真實(shí)性（FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因被定義為差異基因）。利用Blast2GO[21]軟件將差異基因進(jìn)行GO功能注釋?zhuān)瑥亩@得差異表達(dá)基因的GO注釋和分類(lèi)。利用BLAST[20]軟件將差異基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)一步獲得差異表達(dá)基因的Pathway的注釋信息。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組序列的de novo組裝

去除質(zhì)量較低、接頭污染以及N含量過(guò)高的序列后，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得44.54 Mb高質(zhì)量的Clean reads，Q20和Q30的百分比分別為98.86%和96.53%。Clean reads組裝后獲得180，862個(gè)Contigs，Contigs的序列長(zhǎng)度范圍是≥200 bp，序列的平均長(zhǎng)度和N50的長(zhǎng)度分別為547 bp和940 bp，GC%為48.73%。Contigs的片段大小分布：200-500 nt： 73.96%； 600-1000 nt： 12.36%； 1100-1500 nt： 5.61%； 1600-2000 nt： 3.46%； 2100-2500 nt： 1.96%； 2600-3000 nt： 1.04%； ≥3000： 1.60%。轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類(lèi)去冗余得到了66，907個(gè)Unigene，Unigene的平均長(zhǎng)度和N50長(zhǎng)度分別為893 bp和1，540 bp。Unigene的長(zhǎng)度分布：300-500 nt： 50%； 600-1000 nt： 19.82%； 1100-1500 nt： 11.55%； 1600-2000 nt： 7.76%； 2100-2500 nt： 4.55%； 2600-3000 nt： 2.51%；≥3000： 3.80%。

2.2 轉(zhuǎn)錄組序列的KOG功能注釋

利用BLAST將Unigene比對(duì)到Nr、Nt、Swiss-prot、KEGG、KOG、Interpro和GO 七個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中（E<10-5）。結(jié)果顯示，有34，947（52.23%）個(gè)Unigene比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中，22，133（33.08%）個(gè)Unigene比對(duì)到Nt數(shù)據(jù)庫(kù)，23，915（35.74%）個(gè)Unigene比對(duì)到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)到KEGG、KOG、Interpro 和 GO數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigene數(shù)分別為：27，006（40.36%）、 27，886（41.68%）、 25，962（40.30%）和 9，149（13.67%）。

比對(duì)到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中的共有27，886個(gè)Unigene根據(jù)功能劃分屬于25個(gè)功能類(lèi)型（圖1）。其中，“一般功能預(yù)測(cè)”的Unigene數(shù)最多，有8，669個(gè)Unigene，其次是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”，有5，022個(gè)Unigene，最少的是“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”，僅有43個(gè)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組序列的GO功能注釋和表達(dá)譜差異

比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigene參與生物過(guò)程（Biological process）、細(xì)胞組成（Cellular component）和分子功能（Molecular function）3大類(lèi)別55個(gè)小類(lèi)。生物過(guò)程中：“代謝過(guò)程”的Unigene數(shù)最多（4，628個(gè)）， “細(xì)胞進(jìn)程”次之（4，445個(gè)），最少的是“細(xì)胞凋亡”和“移動(dòng)”（分別僅有1個(gè)）。細(xì)胞組分中，“細(xì)胞”所含的Unigene數(shù)最多，有3，823個(gè)，其次是“細(xì)胞部分”，有3，787個(gè)Unigene，“細(xì)胞核”是Unigene數(shù)最少的類(lèi)別，僅有11個(gè)。分子功能中，“催化活化”的Unigene數(shù)最多（4，389個(gè)）。其次是“結(jié)合”（3，985個(gè)），“蛋白標(biāo)簽”僅有1個(gè)Unigene，是分子功能中Unigene數(shù)最少的類(lèi)別。

表達(dá)譜測(cè)序一共測(cè)了3個(gè)樣品，葉柄、珠芽和塊莖各獲得24.08、24.02和24.06 Mb的數(shù)據(jù)，過(guò)濾后的reads數(shù)目占總raw reads的比例分別為99.78%、99.53%和99.70%。差異篩選獲得6，961個(gè)表達(dá)量在葉柄與珠芽、珠芽與塊莖之間同時(shí)存在差異的Unigene，其中有6，576個(gè)比對(duì)到了GO數(shù)據(jù)庫(kù)：細(xì)胞組分2，680個(gè)、生物學(xué)過(guò)程2，556個(gè)、分子功能1，340個(gè)。而轉(zhuǎn)錄組序列GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)時(shí)分別有14，150、18，825和9，724個(gè)Unigene比對(duì)到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類(lèi)。轉(zhuǎn)錄組與表達(dá)譜差異基因GO比對(duì)結(jié)果都表現(xiàn)出“從細(xì)胞組分到生物學(xué)過(guò)程再到分子功能Unigene數(shù)量逐漸減少”的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄組注釋中“代謝過(guò)程”（4，628個(gè)）所含的Unigene數(shù)是最多的，其次是“細(xì)胞進(jìn)程”（4，445個(gè)），“細(xì)胞”（3，823個(gè)）和“細(xì)胞部分”（3，787個(gè)）。表達(dá)譜差異基因功能富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所含Unigene數(shù)最多的是“催化活性”（666個(gè)），其次是“代謝過(guò)程”（646個(gè)），“細(xì)胞進(jìn)程”（611個(gè)）和“細(xì)胞”（528個(gè)）。GO功能注釋的單獨(dú)類(lèi)別中，轉(zhuǎn)錄組注釋和表達(dá)譜差異基因注釋的Unigene數(shù)存在不同（圖2）。

2.4 轉(zhuǎn)錄組序列的KEGG功能注釋和表達(dá)譜差異

從轉(zhuǎn)錄組的27，006個(gè)Unigene中發(fā)現(xiàn)了137條KEGG代謝通路。其中參與“全局路徑”的Unigene最多（6，426個(gè)），其次是“翻譯”途徑（2，580個(gè)）、“糖代謝”（2，287個(gè)）、“折疊、分類(lèi)和降解”（1，705個(gè)）和“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”（1，423個(gè)），Unigene數(shù)最少的是“抗藥性：抗菌劑”代謝途徑（僅8個(gè) Unigene）。表達(dá)譜差異篩選獲得的6，961個(gè)在葉柄、珠芽、塊莖之間同時(shí)存在差異的Unigene中有4，021個(gè)差異基因比對(duì)到了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中。其中參與“全局路徑”的最多（1，044個(gè)），其次是“碳水化合物代謝”（369個(gè)）、“翻譯”（353個(gè)）、“其他次生代謝”（216個(gè)）和“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”（206個(gè)），最少的是“抗藥性：抗菌劑”僅有1個(gè)Unigene。比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)各代謝途徑的轉(zhuǎn)錄組注釋和表達(dá)譜篩選Unigene數(shù)量和比例存在差異（圖3）。

2.5 PEBP家族差異基因篩選

轉(zhuǎn)錄組序列中含有13個(gè)Unigene屬于PEBP基因家族成員，其中有10個(gè)Unigene屬于FT亞家族，TFL亞家族有1個(gè)Unigene，MFT亞家族有2個(gè)Unigene。表達(dá)譜差異基因篩選結(jié)果表明4個(gè)PEBP基因家族的Unigene在不同組織樣品中具有表達(dá)差異：其中屬于FT亞家族的有2個(gè)，屬于的MFT亞家族有2個(gè)，而沒(méi)有屬于TFL亞家族的成員（表1）。

3 討論

滴水珠轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了180，862個(gè)Contig和66，907個(gè)Unigene。其中有27，886（41.68%）個(gè)Unigene成功地比對(duì)到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)，GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分別有9，149（13.67%）和27，006（40.36%）個(gè)Unigene比對(duì)上。葉德等[17]在半夏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)獲得90，175個(gè)Unigene，KOG、GO和KEGG比對(duì)的Unigene數(shù)分別為46，237（51.27%）、31，622（35.07%）和22，961（25.46%）。與半夏轉(zhuǎn)錄組相比，滴水珠比對(duì)到KOG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigene數(shù)比半夏的多，但比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果則相反，推測(cè)可能是因?yàn)槲锓N特異性和測(cè)序量大小不同造成的。

滴水珠表達(dá)譜測(cè)序獲得6，961個(gè)表達(dá)量在葉柄、珠芽、塊莖之間同時(shí)存在差異表達(dá)的Unigene，數(shù)量低于轉(zhuǎn)錄測(cè)序差異篩選的半夏（15，484）和山藥（7，647）[15，17]。差異Unigene數(shù)的不同可能由物種差異及測(cè)序量大小、比較的取樣組織和差異篩選方法不同導(dǎo)致。滴水珠、半夏和山藥的測(cè)序量分別是66，907、90，175和70，480個(gè)Unigene；三種植物比較的取樣組織分別是葉柄vs珠芽vs塊莖、葉柄vs珠芽和鐵棍珠芽vs鐵棍葉腋vs花籽葉腋及下表皮；而表達(dá)量定量方法分別是表達(dá)譜、轉(zhuǎn)錄組和轉(zhuǎn)錄組。

PEBP基因家族（包含有FT、TFL和MFT三個(gè)亞家族）廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[25]。PEBP基因家族參與植物的許多發(fā)育過(guò)程，如植物開(kāi)花[11]、控制氣孔的開(kāi)放[26]、花序分生組織的穩(wěn)定[27]等。雖然滴水珠、半夏的珠芽在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于塊莖[3]，淡黃花百合的珠芽在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于鱗莖[7]，但是珠芽和塊莖/鱗莖發(fā)育的共同分子基礎(chǔ)目前尚無(wú)報(bào)道。滴水珠表達(dá)譜差異Unigene中具有4個(gè)PEBP家族同源序列（FT： 2； MFT： 2； TFL：0），結(jié)果顯示珠芽和塊莖/鱗莖發(fā)育具有共同分子基礎(chǔ)，PEBP基因家族在其中的作用值得進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：江 龍）