姚劉斌 駱禮華 江龍

摘 要：從貴州省遵義市赤水縣、正安縣金佛山方竹林地采集到大型真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定出7科8屬13種，用分子生物學(xué)方法鑒定出其中5種，分別是黃方孢粉褶菌Entoloma murrayi、橙黃乳菇Lactarius aurantiacus、紅菇Russula lepida、乳牛肝菌Suillus bovinus、紅汁乳菇Lactarius hatsudake。

關(guān)鍵詞：金佛山方竹；外生菌根真菌；形態(tài)學(xué)鑒定；分子生物學(xué)鑒定

中圖分類號：Q-9

文獻標識碼： A

金佛山方竹（Chimono bambusa utilis（Keng）Keng f.）是大婁山特有物種，僅分布于海拔1300 m以上雨霧大、濕度大、氣候寒冷的高山，與常綠闊葉樹組成復(fù)層混交林，可涵養(yǎng)水源、保持水土、調(diào)節(jié)區(qū)域氣候[1]。其用途廣泛，可用于建材、造紙等，方竹筍營養(yǎng)豐富、風味獨特[2]，經(jīng)濟價值高[3]。由于立竹密度過大、年齡結(jié)構(gòu)不合理和竹-木結(jié)構(gòu)比例失調(diào)等，導(dǎo)致金佛山方竹在實際生產(chǎn)中“三低” （低產(chǎn)、低質(zhì)、低效）問題突出，病蟲害發(fā)生嚴重，如何改善方竹筍生長狀況，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)的是金佛山方竹生產(chǎn)中的關(guān)鍵問題。大型真菌，特別是外生菌根真菌與植物根系形成的共生體，能有效改善宿主植物的營養(yǎng)狀況，提高抗逆性，促進宿主植物生長，提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)[4-9]，通過接種適宜真菌來解決金佛山方竹生產(chǎn)中的“三低”問題，這是一條潛在的有效方法，所以摸清金佛山方竹中共生真菌的資源狀況尤顯重要。

以金佛山方竹主要分布地貴州省正安縣、赤水縣為采樣地，采集大型真菌，根據(jù)子實體顏色、形狀、大小等形態(tài)學(xué)指標結(jié)合分子生物學(xué)ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方法進行物種鑒定，以期為金佛山方竹生產(chǎn)提供菌種資源。

1 樣品的采集與處理

采樣地位于貴州省正安縣新州鎮(zhèn)、赤水縣大同鎮(zhèn)的金佛山方竹林，海拔1300～1600 m。采樣時，首先用相機拍下其生境，除去子實體表面的泥土和落葉，編號裝入采樣袋中，放入低溫采樣箱，盡快帶回貴州大學(xué)植物生理實驗室4 ℃冰箱保存，保藏時間不超過一周。

2 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)真菌菌蓋的大小、顏色、形狀，菌褶的顏色、稀密，菌柄的長度、直徑、形狀等形態(tài)學(xué)指標，結(jié)合野外拍攝的彩色照片及采樣記錄，參考相關(guān)的工具書對其進行形態(tài)學(xué)鑒定[10-14]。

3 ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA的提取采用biomiga公司的真菌基因組DNA提取試劑盒，操作步驟嚴格按照試劑盒步驟進行。

采用ITS1和ITS4引物來擴增真菌的rDNA ITS序列。PCR反應(yīng)體系：采用25 uL體系，包括有正反向引物各1 uL，DNA模板1 uL，2×PCR Master Mix（含2×Taq DNA polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP）12.5 uL，用ddH2O補至25 uL。擴增反應(yīng)在PCR儀上進行。擴增程序具體參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。用純化后的PCR擴增產(chǎn)物和引物直接測序。測序由上海生工生物工程有限公司進行測序。

4 結(jié)果與分析

4.1 形態(tài)特征

根據(jù)形態(tài)學(xué)指標對采集的大型真菌進行鑒定，共有9科12屬18種（見圖1），其中外生菌根真菌7科8屬13種，形態(tài)學(xué)特征如下：

黃方孢粉褶菌Entoloma murrayi（圖1 1～2），粉褶菌科粉褶菌屬，外生菌根真菌。

菌蓋斗笠型，黃色，寬2.1～4.4 cm，表面光滑發(fā)亮，中間有一明顯的尖狀突起；菌肉薄，淡黃色；菌褶離生，淡黃色，密，不等長；菌柄中生，棍狀，長4.6～9.0 cm，黃色，中空。

子實體散生，生于闊葉林或竹林地上。

赭紅方孢粉褶菌Entoloma quadratum（圖1 3～4），粉褶菌科粉褶菌屬，外生菌根真菌。

菌蓋傘形，寬2～3.5 cm，邊緣為鋸齒狀，表面光滑，黃褐色；菌肉黃色，??；菌褶直生，棕黃色，不等長；菌柄中生，長4.2～7.8 cm，粗0.2～1.0 cm，黃色，中空。

子實體散生，生于闊葉林或竹林地上。

網(wǎng)紋馬勃Lycoperdon perlatum（圖1 5～6），馬勃菌科馬勃菌屬，外生菌根真菌。

子實體倒卵形，高2.4～5 cm，初期白色，后變?yōu)辄S色直至棕灰色，外表面被由無數(shù)細微小疣組成，間有較大易脫的剌。子實體單生或散生于竹林中地上。

朱紅濕傘Hygrocybe miniata（見圖1 7～8），蠟傘科蠟傘屬，外生菌根真菌。

菌蓋扁平半球形，紅色，表面光滑，蠟質(zhì)，寬2～3cm；菌肉薄，淡黃色；菌褶米黃色，稀疏，不等長；菌柄紅色，帶有點橙色，光滑，中空。子實體散生，生于闊葉林中地上。

變黑濕傘Hygrocybe nigrescens（圖1 9～10），蠟傘科蠟傘屬，外生菌根真菌。

菌蓋斗笠形，黑色，寬2.6～3 cm，邊緣開裂；菌肉黑色，??；菌褶白色，密；菌柄長4.2～4.6 cm，粗0.6～0.8 cm，中空。子實體散生，生于針葉林或闊葉林中地上。

蠟傘Hygrocybe ceraceus（圖1 11～12），蠟傘科蠟傘屬，外生菌根真菌。

菌蓋扁平，淡黃色，直徑2～4 cm，表面光滑，蠟質(zhì)，脆；菌肉薄，淡黃色；菌褶直生，稀疏，淺黃色，不等長；菌柄中生，長3～5 cm，粗0.5～0.7 cm，淡黃色，中空。子實體單生，生于林下苔蘚植物間。

桃紅色膠雞油菌Gloeocantharellus persicinus（圖1 13～14），釘菇科粘雞油菌屬。

菌蓋初期半球形后平展，橙紅色，寬3.8～7 cm，邊緣波狀；菌肉白色；菌褶直生，白色，密，不等長；菌柄偏生，長4～5.5 cm，粗0.9～1.5 cm，白帶粉紅色，與菌蓋顏色相近，中空。子實體散生，生于林中地上。

冠鎖瑚菌Clavulina cristata（圖1 15～16），珊瑚菌科鎖瑚菌屬。

多枝，白色，近球形，高3～7 cm，表面光滑；菌肉白色，內(nèi)實。子實體群生，生于闊葉或針葉林中地上。

怡人擬鎖瑚菌Clavulinopsis amoena（圖1 17～18），珊瑚菌科擬鎖瑚菌屬

表面光滑，淡黃色至橙黃色，高3～10 cm，粗0.2～0.6 cm，棍棒狀，頂端尖銳，中空。子實體群生，生于闊葉或針葉林中地上。

金肉桂擬鎖瑚菌Clavulinopsis aurantiocinnabarina（圖1 19～20），珊瑚菌科擬鎖瑚菌屬。

子實體不分支或少許分支，高5.2～15.4 cm，橘紅色，中空；菌肉為黃褐色。子實體群生，闊葉或針葉林中地上。

紅蠟?zāi)accaria laccata（圖1 21～22），白蘑科蠟?zāi)伲馍婢?/p>

菌蓋平展，中央有一顏色較深凸起，寬2.8 cm，紅棕色，表面光滑；菌肉與菌蓋同色，??；菌褶黃棕色，稀疏；菌柄中生，長5.6 cm，粗0.26 cm，纖維質(zhì)，實心。子實體散生，生于針葉林或闊葉林中地上。

竹林擬口蘑Tricholoma ionides（圖1 23～24），白蘑科擬口蘑屬。

菌蓋傘形至平展，直徑4.1～6.6 cm，，黃褐色，表面密被鱗片，蓋中央為黑褐色；菌肉淡黃色；菌褶近直生，白色，密；菌柄中生，長3～4.6 cm，粗0.6～0.8 cm，圓柱形，中空。子實體散生，生于有較厚的竹葉落葉層的竹和闊葉樹的混交林下。

乳牛肝菌Suillus bovinus（圖1 25～26），乳牛肝菌科乳牛肝菌屬，外生菌根真菌。

菌蓋半球形至扁平，寬3.8～5.5 cm，土黃色，濕時較黏；菌肉淡黃色；菌管淡黃褐色；管孔復(fù)式，大，呈輻射狀排列，孔徑約1 mm；菌柄長3.5～5.6 cm，粗0.8～1.2 cm，近圓柱狀。

生態(tài)習性：子實體散生或群生，生于松林及其他針葉林中地上。

小雞油菌Cantharellus cibarius（圖1 27～28），雞油菌科雞油菌屬，外生菌根真菌。

子實體小，肉質(zhì)，呈喇叭形，寬2.6 cm，雞油黃色，表面光滑；菌肉淺黃色，較厚；菌褶延生，淡黃色，稀疏；菌柄長4.6 cm，粗0.8 cm，淺黃色。子實體散生，生于闊葉林中地上。

橙黃乳菇Lactarius aurantiacus（圖1 29～30），紅菇科乳菇屬，外生菌根真菌。

菌蓋平展，中間下凹，寬4.2 cm，橙紅色，表面光滑；菌肉結(jié)實，氣味弱，有白色乳汁；菌褶延生，黃棕色，密；菌柄中生，長3.4 cm，粗0.8 cm，黃棕色，柱形，中空。子實體群生，生于針葉林或闊葉林中地上。

紅汁乳菇Lactarius hatsudake（圖1 31～32），紅菇科乳菇屬，外生菌根真菌。

菌蓋扁平狀，中間下凹，寬7.6 cm，黃色；菌肉黃色，受傷后漸變?yōu)辄S綠色；菌褶延生，黃色，密；菌柄中生，長2.6 cm，粗1.1 cm，黃色，中空。子實體單生，生于針葉林闊葉林中地上。

紅菇Russula lepida（圖1 33～34），紅菇科紅菇屬，外生菌根真菌。

菌蓋平展，中央微凹，寬7.2 cm，紅色，濕是表面有點黏，表皮易撕下；菌肉白色；菌褶直生，白色，等長；菌柄中生，長3.5 cm，粗1.4 cm，圓柱形，白色，中實。子實體單生，生于針葉林闊葉林中地上。

變綠紅菇Russula virescens（圖1 35～36），紅菇科紅菇屬，外生菌根真菌。

菌蓋平展，中央微凹，寬7.3 cm，淺綠色，表皮龜裂形成不規(guī)則的塊狀小斑；菌肉白色，質(zhì)脆；菌褶直生，白色，等長，密；菌柄中生，長5.6 cm，粗1.7 cm，圓柱形，白色，內(nèi)部海綿質(zhì)。子實體單生，生于針葉林或闊葉林中地上。

4.2 5種外生菌根真菌的ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ITS1和ITS4引物來擴增6（黃方孢粉褶菌）、79（橙黃乳菇）、M2（紅菇）、M3（乳牛肝菌）、M10（紅汁乳菇）的rDNA ITS序列，測序結(jié)果如下：

所得的序列運用GenBank的序列局部相似性查詢系統(tǒng)，在GenBank數(shù)據(jù)庫下載與所測DNA序列相似的序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，可分為4個聚類群（見圖2）， 79，M10在分類群Lactarius，M2在分類群Russula，M3在分類群Suillus，6在分類群Entoloma。并且這5種外生菌根真菌的分子鑒定與形態(tài)鑒定一致，分別是：6為黃方孢粉褶菌Entoloma murrayi，79為橙黃乳菇Lactarius aurantiacus，M2為紅菇Russula lepida，M3為乳牛肝菌Suillus bovinus，M10為紅汁乳菇Lactarius hatsudake。

5 討論

本研究通過在金佛山方竹林中采集大型真菌標本，通過形態(tài)學(xué)觀察對金佛山方竹林地中部分大型真菌進行鑒定，共鑒定出12屬18種，其中包括外生菌根真菌8屬13種。結(jié)合分子生物學(xué)鑒定外生菌根真菌得到5種外生菌根真菌與形態(tài)學(xué)鑒定相一致，分別為黃方孢粉褶菌Entoloma murrayi、橙黃乳菇Lactarius aurantiacus、紅菇Russula lepida、乳牛肝菌Suillus bovinus、紅汁乳菇Lactarius hatsudake。結(jié)合初步調(diào)查顯示[15]，證明了金佛山方竹可與外生菌根真菌形成菌根結(jié)構(gòu)，金佛山方竹林地中擁有著豐富的外生菌根真菌資源，為外生菌根真菌在金佛山方竹上的應(yīng)用提供了菌種資源。

外生菌根真菌在生態(tài)系統(tǒng)上有著不容忽視的作用，研究表明，外生菌根真菌對巖石和礦物的風化作用可對生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循壞過程產(chǎn)生影響，并提高土壤養(yǎng)分的生物有效性[16]。接種外生菌根真菌形成共生結(jié)構(gòu)，可以提高植物成活率，促進植物生長[17-19]。張揚等人將外生菌根真菌接種到濕地松上，證明接種后能提高濕地松成活率，顯著地促進濕地松生長[20]。馬瓊將外生菌根真菌接種到馬尾松幼苗，證明接種后幼苗的生長、菌根侵染率和氮磷鉀含量均優(yōu)于對照[21]。外生菌根真菌通過影響植物根系活力、根系質(zhì)膜相對透性、提高硝酸酶活性、增加葉綠素含量等方式，使地上與地下部分協(xié)同作用，促進植物生長[22]。外生菌根真菌對于金佛山方竹育苗、造林、改善生態(tài)系統(tǒng)等方面具有重要意義[23]，。因此接種外生菌根真菌在金佛山方竹上來提高其移植率、產(chǎn)量、品質(zhì)等具有廣闊的前景。

參考文獻：

[1]鄭翼，羅吉斌.金佛山方竹育苗與造竹技術(shù)[J].林業(yè)科技開發(fā)，2008（03）：115-116.

[2]張喜，龍志永，許才萬，等.金佛山方竹不同密度人工林筍產(chǎn)量研究[J].世界竹藤通訊，2013（11）： 16-20.

[3]李曙明，張佐玉，杜凌，等.金佛山方竹低產(chǎn)林改造技術(shù)[J].林業(yè)實用技術(shù)，2008（5）：20-22.

[4]樊永軍，閆偉.內(nèi)蒙古地區(qū)白樺外生菌根形態(tài)類型及分子鑒定[J].西北植物學(xué)報，2013，33（11）：2209-2215.

[5]王志勇，李曉宏，胡博.外生菌根菌的研究進展[J].湖北林業(yè)科技，2005（03）：42-45.

[6]葉文蘭，駱禮華，江龍. 金佛山方竹根圍叢枝菌根真菌的初步研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2017，36（2）：25-30.

[7]葉文蘭，駱禮華，嚴璐，等. 金佛山方竹根際土壤中優(yōu)勢AM真菌的鑒定[J]. 竹子學(xué)報，2017，36（2）：36-43.

[8]于萌，崔明，申鴻，黃建國.外生菌根真菌對油松幼苗生長的影響[J].四川林業(yè)科技，2011，32（02）：45-48.

[9]陳永鋒.金佛山方竹的育苗技術(shù)[J].世界竹藤通訊，2008（04）：24-26.

[10]袁騰，陶光耀，江龍. 梵凈山4種林型土壤叢枝菌根真菌多樣性[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，46（3）：83-86.

[11]溫祝桂，陳亞華.中國外生菌根真菌研究進展[J].生物技術(shù)通報，2013（02）：22-30.

[12]吳興亮.中國梵凈山大型真菌[M].北京：科學(xué)出版社，2014.

[13]黃年來.中國大型真菌原色圖鑒[M]北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[14]吳興亮.中國熱帶真菌[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[15]嚴璐，姚劉斌，江龍.竹林外生菌根真菌資源的初步調(diào)查[J].貴州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，34（02）：21-25.

[16]魏松坡，賈黎明.外生菌根真菌對礦物風化作用研究進展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2014，33（12）：3447-3454.

[17]閻秀峰，王琴.接種外生菌根對遼東櫟幼苗生長的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報，2002（06）：701-707.

[18]宋瑞清，鞠洪波，祁金玉，周博如.外生菌根菌對樟子松苗木生長的影響[J].菌物研究，2007（03）：142-145.

[19]Ying Long Chen，Bernard Dell，Nicholas Malajczuk. Effect of Scleroderma Spore Density and Age on Mycorrhiza Formation and Growth of Containerized Eucalyptus globulus and E. urophylla Seedlings [J]. New Forests，2006，31（3）.

[20]張揚，曾麗瓊，葉建仁，吳小芹，張林平.接種外生菌根真菌對濕地松林促生效應(yīng)及根際微生物數(shù)量的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，38（05）：57-61.

[21]馬瓊，黃建國，蔣劍波.接種外生菌根真菌對馬尾松幼苗生長的影響[J].福建林業(yè)科技，2005（02）：85-88.

[22]陳桂梅.油松菌根伴生真菌與外生菌根真菌的互作研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

[23]張茹琴，唐明，張海涵，杜小剛.秦嶺火地塘林區(qū)外生菌根真菌的初步調(diào)查[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，28（03）：168-173.

（責任編輯：曾 晶）