辛博 ,陳力,萬麗麗,郭澄*

(1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上?！?00233;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上?！?01203)

野黃芩苷(Scutellarin,SCU)是從傳統(tǒng)中草藥菊科植物短莖飛蓬[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz]的干燥全草中提取的一種黃酮類單體。現(xiàn)有研究表明，野黃芩苷對(duì)心血管疾病有顯著的藥理作用，包括舒張血管、對(duì)缺血再灌注心臟和內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用、抗炎、抗凝、抗血栓、抗心律失常等[1]，但其對(duì)心肌纖維化的作用機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)和促分裂素原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的主要組成部分，也是心肌纖維化相關(guān)的重要通路。研究顯示， ERK1/2和p38-MAPK通路可有效抑制細(xì)胞外基質(zhì)分泌和心肌纖維化的發(fā)展[2]?；诖?，本研究以血管緊張素II (Angiotension II,ANG II) 誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠為對(duì)象，探討野黃芩苷對(duì)心肌纖維化及ERK1/2和p38-MAPK通路蛋白表達(dá)的影響。

1　材料

1.1　動(dòng)物

6周齡雄性C57BL/6小鼠，購自上海西普爾-畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房。正常飲水、飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2　藥品與試劑

Alzet植入式膠囊滲透壓泵1004型(美國Alzet公司)；野黃芩苷對(duì)照品(Scutellarin，SCU，>98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16030406)；血管緊張素II (Angiotensin II，ANG II，≥93%，美國Sigma公司，批號(hào)SLBH9339V)；羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)A030-1)；SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)Q341-02)；p38-MAPK抗體(美國Santa Cruz 公司，批號(hào)sc-7972)；p-p38-MAPK抗體(美國Santa Cruz 公司，批號(hào)sc-166182)；ERK1/2抗體(美國Santa Cruz 公司，批號(hào)sc-514302)；p-ERK1/2抗體(美國Santa Cruz 公司，批號(hào) sc-136521)；GAPDH抗體(杭州華安生物有限公司，批號(hào)EM1101)；IRDyeTM 800熒光二抗(美國LI-COR公司，批號(hào)C60726-02，C60716-02)；硝酸纖維素膜(美國Pall公司)。

1.3　儀器

臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；凝膠電泳儀(美國 Bio-rad公司)；PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

2　方法

2.1　分組及給藥

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組(Normal 組)，血管緊張素II模型組(ANG II 組)，血管緊張素II+野黃芩苷干預(yù)組(ANG II+SCU 組)和野黃芩苷對(duì)照組(SCU 組)。正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水2.5 mg/(kg·d)，同時(shí)每天給予 40 mg/kg 0.5% 羧甲基纖維素鈉灌胃； ANG II組皮下藥物滲透泵持續(xù)滴注ANG II 2.5 mg/(kg·d)，同時(shí)每天給予40 mg/kg 0.5% 羧甲基纖維素鈉灌胃；ANG II+SCU組皮下藥物滲透泵持續(xù)滴注ANG II 2.5 mg/(kg·d)，同時(shí)每天給予野黃芩苷40 mg/kg灌胃；SCU組腹腔注射生理鹽水2.5 mg/(kg·d)，同時(shí)每天給予野黃芩苷40 mg/kg灌胃。4周后處死小鼠，迅速取出心臟，取左室心肌組織，留取部分放入中性福爾馬林溶液中制作石蠟切片，其余部分-80℃保存，備用。

2.2　Masson’s trichrome染色觀察心肌組織纖維化面積

石蠟切片脫水后，按Masson染色試劑盒進(jìn)行操作，倒置顯微鏡觀察心肌組織膠原沉積程度，膠原部分呈藍(lán)色，正常部分為紅色。

2.3　心肌組織中羥脯氨酸含量檢測(cè)

取心肌組織約50 mg， 按試劑盒說明書操作，測(cè)定各組心肌中HYP的含量。1)消化：取15 mL離心管，空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管分別加入0.5 mL的雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和待測(cè)樣本，同時(shí)加入0.05 mL的消化液。2)含量測(cè)定：每管加入試劑一0.5 mL，混勻，室溫靜置10 min;每管加入試劑二0.5 mL，混勻，室溫靜置5 min；每管加入試劑三1 mL，混勻，60℃水浴15 min，流水冷卻后，3 500 r/min離心10 min，取上清200 μL在550 nm處測(cè)定吸光度。按公式計(jì)算各組羥脯氨酸含量。

羥脯氨酸含量(μg/mL)=(測(cè)定吸光度管-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5 μg/mL)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

2.4　RT-qPCR 檢測(cè)心肌組織中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ 和α-SMA mRNA表達(dá)

提取RNA后，取500 ng，按試劑盒說明書操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量RT-qPCR (10 μL 體系)， 測(cè)定各組心肌組織中Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA的mRNA表達(dá)水平。

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，各引物序列如下：GAPDH： forward，5′-TGA TTC TAC CCA CGG CAA GTT-3′，reverse 5′-TGA TGG GTT TCC CAT TGA TGA-3′； Col1：forward，5′-ACG TCC TGG TGA AGT TGG TC-3′，reverse，5′-TCC AGC AAT ACC CTG AGG TC-3′；Col3：forward，5′-AGG CCA ATG GCA ATG TAA AG-3′，reverse，5′-TAT TGG TGG GTG AAA CAG CA-3′；α-SMA，forward，5′-ATG ACA TGA CTG AAG CA-3′，reverse，5′-TTC TCT GTG GAG CTG AAG CA-3′。

RT-qPCR反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s；之后95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析。

2.5　Western blot檢測(cè)心肌組織中ERK1/2和p38-MAPK蛋白的表達(dá)

稱取心肌組織約50 mg于預(yù)冷的碾缽中，加入液氮碾碎成粉末狀，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。依次進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入ERK1/2、p-ERK1/2、p38-MAPK、p-p38-MAPK和GAPDH一抗，4℃孵育過夜，加入IRDyeTM 800熒光二抗孵育2 h，Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描印跡。對(duì)各組條帶進(jìn)行灰度分析，將各目的蛋白灰度值和內(nèi)參灰度值比較，得到相對(duì)表達(dá)量。

2.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3　結(jié)果

3.1　野黃芩苷減少ANG II誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化組織中膠原沉積

顯微鏡下可見，Normal組和SCU組心肌纖維排列整齊，呈束狀，結(jié)構(gòu)正常。ANG II組心肌纖維呈波浪狀，排列較紊亂，且組織間質(zhì)膠原含量明顯增多。ANG II+SCU組心肌纖維排列較ANG II組見整齊，膠原沉積顯著降低，心肌纖維化面積減少。 單獨(dú)給予野黃芩苷不影響心肌結(jié)構(gòu)。結(jié)果見圖1。

圖1　心肌組織 Masson’s trichrome染色結(jié)果注：A:Normal 組；B:ANGII 組；C:ANG II+SCU組;D:SCU 組

3.2　野黃芩苷降低ANG II誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠心肌組織中羥脯氨酸的含量

HYP含量測(cè)定結(jié)果顯示(圖2)，相對(duì)于 Normal組(133.2±5.50)μg/g，ANG II組心肌組織HYP的含量顯著增加，為(330.7±19.18)μg/g；而 ANG II+SCU組HYP含量與 ANG II 組相比明顯下降，為(182.2±10.35)μg/g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SCU HYP含量為(109.6±7.21)μg/g，與正常對(duì)照組無顯著性差異。

圖2　心肌組織羥脯氨酸含量測(cè)定(n=3)注：與正常組比較，*P<0.05；與ANGII模型組比較，#P<0.05

3.3　野黃芩下調(diào)ANGII誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠心肌組織中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ 和α-SMA mRNA表達(dá)

為了進(jìn)一步證明野黃芩苷的抗心肌纖維化作用，我們利用RT-qPCR檢測(cè)ANGII誘導(dǎo)的纖維化小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)基因mRNA水平的變化情況，結(jié)果如圖3所示。以Normal組的mRNA表達(dá)水平為基值1，在ANGII模型中，CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA的mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；而相較于模型組，野黃芩苷能夠降低心肌纖維化組織中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和α-SMA的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。說明野黃芩苷能夠抑制心肌纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，表現(xiàn)出抗心肌纖維化的作用。

圖3　野黃芩對(duì)ANG II誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠心肌組織中Collagen I，Collagen Ⅲ和α-SMA mRNA 水平的影響注：與正常組比較，*P<0.05；與ANGII模型組比較，#P<0.05

3.4　野黃芩對(duì)ANGII誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠心肌組織中p-ERK1/2和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響

與Normal組相比較，ANGII模型組p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白表明顯升高，給予野黃芩苷干預(yù)后，p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白表達(dá)顯著降低。SCU單獨(dú)給藥組與Normal組p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白無顯著差別。各組ERK1/2和p38-MAPK總蛋白表達(dá)無明顯變化。結(jié)果見圖4。

圖4　Western blot檢測(cè)各組心肌組織中p-ERK1/2(A)和p-p38 MAPK(B)蛋白表達(dá)

4　討論

心肌纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積造成心臟順應(yīng)性下降為主的一種復(fù)雜的病理生理過程。心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制與多種因素相關(guān)，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，炎癥因子，生長因子TGF-β、PDGF等[3]。本研究采用皮下植入膠囊滲透壓泵的方法，連續(xù)4周持續(xù)滴注ANG II。Masson’s trichrome病理切片結(jié)果顯示，小鼠心肌間質(zhì)膠原含量顯著增多，出現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化現(xiàn)象。ANGII組小鼠心肌組織中HYP含量增加，同時(shí)纖維化相關(guān)基因CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照組上調(diào)，說明ANGII誘導(dǎo)了小鼠心肌纖維化的發(fā)生。

中醫(yī)藥可以通過調(diào)節(jié)心血管活性物質(zhì)而改善心肌纖維化[4-7]。大量研究表明單味中藥和中藥單體提取物如苦參堿、鉤藤堿、葛根素、姜黃素等可有效抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[8]。中草藥菊科植物短莖飛蓬[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz]的干燥全草在臨床上常用來治療心腦血管疾病，其主要有效成分即為野黃芩苷。目前野黃芩苷對(duì)心臟作用的研究主要集中在其對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用方面[9-13]，與纖維化相關(guān)的研究較少。Zhou H 研究顯示，野黃芩苷可有效抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Epithelial-mesenchymal transition(EMT)過程[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠連續(xù)4周給予野黃芩苷40 mg/kg灌胃后，心肌間質(zhì)膠原含量顯著性下降，同時(shí)羥脯氨酸和CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA基因mRNA表達(dá)水平也明顯降低。說明野黃芩苷可有效抑制ANGII誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化發(fā)生。

ERK1/2和p38-MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中主要的成員，調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化和炎癥應(yīng)答等多種重要病理生理過程。研究顯示，ERK1/2及p38-MAPK通路的激活與心肌纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[15]。有報(bào)道證實(shí)ERK1/2及p38-MAPK的抑制劑可有效抑制心肌梗死造成的大鼠心肌纖維化[16]。本研究結(jié)果表明，ANGII可激活心肌中ERK1/2和p38-MAPK通路，使其磷酸化水平顯著增加，而野黃芩苷能夠抑制ERK1/2和p38-MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)，提示野黃芩苷可能通過抑制ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化發(fā)揮功能，從而抑制心肌外基質(zhì)的沉積和心肌纖維化發(fā)展。

綜上所述，本研究初步探討了野黃芩苷對(duì)ANGII誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化影響作用，為中醫(yī)藥抗心肌纖維化新藥的研發(fā)提供了有利的參考。