程玉鵬，王洪月，馬愛萍，李弘琨，寧愿，姜麗麗，任朋英

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江　哈爾濱　150040)

龍膽科(Gentianaeeae)龍膽屬(Gentiana)植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)為多年生草本植物。2015版《中國藥典》[1]收錄條葉龍膽入藥部位為干燥根及根莖,在我國內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、貴州等地產(chǎn)量較多，朝鮮、日本等地也有分布。龍膽中主要含龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、三葉苷、龍膽堿和龍膽多糖等化學(xué)成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明， 龍膽提取物不但具有抗氧化、抗水腫[2-3]、抗菌[4-5]、鎮(zhèn)痛、降血脂，抗炎、保肝及健胃利膽等作用[6]，同時(shí)也具有抗腫瘤、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[7]。

由于龍膽為多年生草本植物，近年環(huán)境又不斷的惡化，野生龍膽資源已匱乏，目前正努力尋找其他途徑去開發(fā)龍膽資源，其中通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得藥用資源是解決該問題的有效方法。因其具有生長(zhǎng)速度快、易于大規(guī)模培養(yǎng)和易于有效成分的分離提取等優(yōu)點(diǎn)，因而成為藥用植物資源最有前景的替代資源[8]。本課題主要研究對(duì)條葉龍膽的組培體系(愈傷組織)進(jìn)行提取，用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇及水進(jìn)行分層萃取，確定其體外抗肝癌的有效部位。

1　材料

1.1　儀器

DL-CT-2NDIA超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；RT-6000酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；IL-185VT CO2培養(yǎng)箱(STIK)；熒光倒置顯微鏡(Germany leica instrument co.， Ltd)；移液器(Thermo Scientific)。

1.2　試藥

無水乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(Biological industries)；青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，上海星科生物科技有限公司)；胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3　細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞購買于ATCC細(xì)胞庫。

1.4　愈傷組織

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分子鑒定和哈爾濱師范大學(xué)王臣教授形態(tài)學(xué)鑒定該樣品來自龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)。

2　方法

2.1　條葉龍膽愈傷組織繼代培養(yǎng)

MS固體培養(yǎng)基按照30 g/L加入蔗糖，再分別加入已配置好的激素母液，濃度分別為：6-BA 0.5 mg/L，2， 4-D 2.0 mg/L，KT 0.5 mg/L。選取培養(yǎng)3周長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)接繼代。

2.2　條葉龍膽愈傷組織萃取物的制備

收集培養(yǎng)3周的條葉龍膽愈傷組織，去除愈傷組織表面的培養(yǎng)基，將愈傷組織于恒溫50℃烘干至恒重。分別精密稱取5.0 g條葉龍膽愈傷組織粉末裝入圓底燒瓶中，按照1∶40料液比加入70%乙醇，回流提取連續(xù)2次，每次2 h。常壓過濾，收集濾液，將濾液置于50℃烘箱中烘干，得到龍膽愈傷組織乙醇提取物。將得到的龍膽愈傷組織乙醇提取物加適量蒸餾水成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取。萃取后得到的溶液置于烘箱揮發(fā)溶劑，得到石油醚層提取物、乙酸乙酯層提取物、水飽和正丁醇和水層萃取物。制成粉末于離心管中,-20℃儲(chǔ)藏備用。

2.3　MTT法檢測(cè)條葉龍膽愈傷組織萃取物對(duì)HepG-2細(xì)胞的作用

2.3.1陽性藥物給藥濃度的確定

取對(duì)數(shù)期肝癌細(xì)胞HepG-2，消化并收集細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清和1%雙抗的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，按照每孔100 μL的量分別接種于96孔板內(nèi)，5% CO2、37℃培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后吸取上清，加入100 μL無血清培養(yǎng)基配置的陽性藥紫杉醇。按照濃度2、4、8、16、20、30 μg/mL給藥，陰性對(duì)照組只加入含0.1% DMSO的無血清培養(yǎng)基，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT(濃度為5 mg/mL)10 μL，使其終濃度為0.5 mg/mL，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻，490 nm處檢測(cè)OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.2條葉龍膽愈傷組織萃取物的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組：陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和給藥組(不同濃度)，每組4個(gè)復(fù)孔。其中陽性對(duì)照組加入100 μL IC50所對(duì)應(yīng)的紫杉醇濃度溶液，陰性對(duì)照組只加入含0.1% DMSO的無血清培養(yǎng)基，給藥組分別加入100 μL含有不同濃度(DMSO終濃度<0.1%)無血清培養(yǎng)基配置的條葉龍膽愈傷組織石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇及水萃取物。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2給藥濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL，其余操作同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按照如下公式計(jì)算：

抑制率(%)=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100%

2.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(mean±SD)表示。采用SPSS22.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和Dunnett檢驗(yàn)。P≤0.05為具有顯著性差異；P≤0.01為具有極顯著性差異。

3　結(jié)果

3.1　紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制作用

結(jié)果見圖1，紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制作用與給藥濃度和時(shí)間呈正相關(guān)，具有一定的依賴性，IC50值為17.28 μg/mL。

圖1　紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制作用注：空白對(duì)照組：DMSO<0.1%，抑制率(%)=0；與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2　條葉龍膽愈傷組織萃取物對(duì)HepG-2細(xì)胞的體外增殖抑制作用

結(jié)果如圖2所示，條葉龍膽愈傷組織石油醚、乙酸乙酯萃取物對(duì)體外培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)良好的濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系，IC50分別為62.83 μg/mL和 73.06 μg/mL。而條葉龍膽愈傷組織的水飽和正丁醇及水萃取物的活性則較差，無明顯抑制細(xì)胞作用。

圖2　條葉龍膽愈傷組織萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制作用注：空白對(duì)照組：DMSO<0.1%，抑制率(%)=0；與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

4　討論

生長(zhǎng)過快或是無限生長(zhǎng)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的特征之一，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，是抗腫瘤的有效辦法[9-11]。龍膽作為傳統(tǒng)的保肝藥物，現(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究證實(shí)其具有抗癌的作用[12]。組培體系易于大規(guī)模培養(yǎng)，易提取，且充分保留活性成分等優(yōu)點(diǎn)，為資源短缺問題提供解決辦法。MTT法因其經(jīng)濟(jì)且靈敏度高，已廣泛用于檢測(cè)生物活性因子，大規(guī)模篩選抗種瘤藥物及測(cè)定腫瘤放射敏感性等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法，考察評(píng)價(jià)了條葉龍膽愈傷組織萃取物體外抗腫瘤活性，以對(duì)HepG-2細(xì)胞具有很好抑制作用的紫杉醇為陽性對(duì)照藥，IC50值為17.28 μg/mL，條葉龍膽愈傷組織石油醚、乙酸乙酯萃取物與陽性對(duì)照藥相比，對(duì)HepG-2細(xì)胞的抑制作用稍弱，IC50分別為62.83 μg/mL和73.06 μg/mL，但是二者對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，在紫杉醇資源日益短缺的今天，龍膽萃取物也同樣具有抗腫瘤效果。雖然水飽和正丁醇和水萃取物也對(duì)HepG-2具有一定抑制作用，但效果不明顯,且不成量效關(guān)系。故確定條葉龍膽愈傷組織石油醚、乙酸乙酯萃取物為抗腫瘤有效部位，其抗腫瘤作用的有效單體化學(xué)成分及其結(jié)構(gòu)修飾、作用的分子機(jī)制等有待進(jìn)一步深入研究。