徐玉鈺 馬澤剛

[摘要]目的探討α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠早期認知功能的改變及其可能的機制。

方法選取3月齡α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，采用新物體識別和轉(zhuǎn)棒儀實驗觀察小鼠的認知及運動功能，采用Western Blot方法觀察小鼠海馬和前額葉皮質(zhì)內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達，采用免疫組織化學(xué)的方法觀察小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。

結(jié)果新物體識別實驗表明，與野生型小鼠相比，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)認知功能障礙。Western Blot檢測顯示，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬和前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF的表達較野生型小鼠下調(diào)（t=2.584、4.189，P<0.05）。A53T轉(zhuǎn)基因小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上的停留時間與野生型小鼠相比差異無顯著性（P>0.05），黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目與野生型小鼠相比也無明顯改變（P>0.05）。

結(jié)論3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)認知功能障礙且早于運動癥狀的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]A53T小鼠;認知功能障礙;帕金森病;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

[中圖分類號]R741

[文獻標志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02020204

帕金森?。≒D）是一種常見的神經(jīng)退變性疾病，其病理表現(xiàn)主要是黑質(zhì)致密部多巴胺（DA）能神經(jīng)元的選擇性死亡和腦內(nèi)路易小體的形成[13]。α突觸核蛋白是PD特征性病理標志物路易小體的主要成分，在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元中廣泛存在[45]。在某些因素作用下，α突觸核蛋白可發(fā)生構(gòu)象變化形成聚集體，并引起DA能神經(jīng)元的死亡[4，6]。PD經(jīng)典的運動癥狀包括靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢不穩(wěn)等[7]。然而，一些非運動癥狀如嗅覺障礙、認知

[LL]能力下降、記憶力減退等可在運動癥狀出現(xiàn)之前發(fā)生或伴隨著運動癥狀而發(fā)生[812]。目前，PD的研究多集中在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)上。但有研究表明，只有當(dāng)黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元損傷或缺失達到80%以上時，才能出現(xiàn)明顯的運動癥狀[13]。因此，對PD早期非運動癥狀進行研究并在發(fā)病前及時干預(yù)，將有利于延緩或阻止PD的發(fā)病進程。α突觸核蛋白A53T轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶了人突變型α突觸核蛋白A53T基因，且其運動癥狀出現(xiàn)較晚，可模擬PD發(fā)病過程中神經(jīng)病理學(xué)過程的改變，是研究PD早期非運動癥狀的理想實驗?zāi)Ｐ汀１狙芯恳栽撃Ｐ褪鬄閷嶒瀸ο?，探討PD早期認知功能的改變以及可能的機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料和動物

實驗所用試劑除做特別說明外，均購自美國Sigma公司。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）抗體為美國abcam公司產(chǎn)品，βactin抗體為中國博奧森公司產(chǎn)品。選取20只雄性健康3月齡C57/BL6小鼠（其中A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠各10只），體質(zhì)量（22±2）g，由安徽博源實驗動物有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)溫度為（19±2）℃，12 h/12 h晝夜自動循環(huán)光照，自由進食、飲水。

1.2實驗方法

1.2.1轉(zhuǎn)棒實驗轉(zhuǎn)棒實驗可以評估小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。小鼠首先被放置在靜置的轉(zhuǎn)棒上適應(yīng)2 min，然后旋轉(zhuǎn)桿以4～40 r/min均勻加速共5 min。實驗期間，小鼠掉下轉(zhuǎn)棒或在轉(zhuǎn)棒上連續(xù)跑超過5 min，系統(tǒng)會自動停止，并記錄小鼠停留在旋轉(zhuǎn)桿上的時間。實驗每天測試3次，連續(xù)3 d，取平均值。每次測試時間間隔不小于1 h。

1.2.2新物體識別該實驗周期為5 d。前3 d是適應(yīng)期：每只小鼠放置在測試箱內(nèi)熟悉環(huán)境，測試箱內(nèi)不放置任何物品，10 min后把小鼠放回原飼養(yǎng)籠內(nèi)。第4天為熟悉期：將小鼠放回裝有兩個完全相同物體的測試箱中，讓小鼠自由探索，訓(xùn)練持續(xù)10 min。第5天為測試期：先讓小鼠在測試箱內(nèi)自由探索兩個相同的物體10 min，1 h后進行記憶測試。測試期和熟悉期過程類似，只是測試箱內(nèi)的兩個相同的物體中的一個被改變，測試5 min。每次測試結(jié)束后，用體積分數(shù)0.75乙醇清洗物體和箱子，以減少物體上的氣味。如果小鼠在1 cm之內(nèi)指向或用鼻子觸及物體，則視為探索行為。用攝像機記錄測試視頻，離線分析并記錄小鼠對新舊物體的探索時間。

1.2.3酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經(jīng)元免疫熒光化學(xué)染色行為學(xué)實驗結(jié)束后，每組取5只小鼠用80 g/L水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉，先用37 ℃生理鹽水灌注心臟15 min，待流出的液體變清澈后，快速換成40 g/L多聚甲醛灌注10 min，然后在冰上快速斷頭取腦。用40 g/L多聚甲醛在4 ℃下固定6 h，300 g/L蔗糖脫水24～48 h后，用包埋液將整個腦組織包埋后，進行連續(xù)冠狀切片，切片厚度為20 μm。將收集的腦片放置在24孔板中，進行黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元熒光染色及計數(shù)。1×PBS沖洗3次后，將腦片放置在配置好的兔抗小鼠TH一抗（1∶2 000）中，每孔300 μL，4 ℃搖床過夜。1×PBS沖洗3次后，每孔加入300 μL的山羊抗兔熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育2 h。1×PBS沖洗3次后，將腦片貼于載玻片上并用體積分數(shù)0.70甘油封片。使用蔡司顯微鏡進行掃描，計數(shù)黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元總數(shù)。

1.2.4Western Blot方法檢測海馬和前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白的表達行為學(xué)實驗后，每組取5只小鼠，冰上快速斷頭取腦，分離出左右兩側(cè)海馬和前額葉，分別稱質(zhì)量后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。? mg組織中加入100 μL混合裂解液（RIPA與PMSF以體積分數(shù)99∶1混合而成），研磨成勻漿，于冰上靜置裂解30 min。4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸出上清，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)過SDSPAGE電泳并濕轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上。切出帶有目的蛋白的條帶，用50 g/L脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，分別用BDNF（1∶500）、βactin（1∶10 000）一抗于4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，分別用羊抗鼠HRPIgG（1∶10 000）和羊抗兔HRPIgG（1∶10 000）二抗室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光液進行顯影，用LSUVP Vision WorksTM LS軟件掃描后進行統(tǒng)計分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，兩獨立樣本均數(shù)比較采用 Students t檢驗。P<0.05表示差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1A53T轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠認知功能比較

實驗結(jié)果表明，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠對新物體的探索時間為（52.70±4.96）s，對舊物體的探索時間為（45.24±2.51）s，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠對新舊物體的探索時間比較差異無顯著性（P>0.05）;野生型小鼠對新物體的探索時間為（62.23±4.32）s，對舊物體的探索時間為（44.87±1.79）s，野生型小鼠對新物體的探索時間明顯長于對舊物體的探索時間（t=3.283，P<0.01）。兩組小鼠對新舊兩種物體的總探索時間差異無顯著性（P>0.05）。

2.2A53T轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠海馬和前額葉皮質(zhì)BDNF蛋白水平比較

A53T轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠海馬的BDNF

水平分別為0.691 8±0.063 4和1.025 0±0.112 1，兩組比較差異有顯著意義（t=2.584，P<0.05）。A53T轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠腦前額葉皮質(zhì)的BDNF水平分別為0.300 8±0.033 4和0.466 6±0.023 7，兩組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.189，P<0.01）。

2.3A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠運動協(xié)調(diào)能力比較

野生型小鼠停留在旋轉(zhuǎn)桿的時間為（267.1±7.4）s，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠為（274.8±10.0）s，兩組比較差異無顯著性（P>0.05）。

2.4A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目比較

野生型小鼠的黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元為（6 945±

261）個，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠為（6 194±316）個，兩組比較差異無顯著性（P>0.05）。

3討論

DA作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可控制情緒和運動能力[14]。本文研究結(jié)果顯示，3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠運動協(xié)調(diào)能力并無改變，且其黑質(zhì)區(qū)DA標志物TH陽性神經(jīng)元數(shù)目也沒有明顯改變，提示3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)區(qū)無明顯損傷。推測調(diào)節(jié)運動功能的紋狀體DA含量可能也沒有明顯變化，這可能是A53T轉(zhuǎn)基因小鼠運動協(xié)調(diào)能力無明顯障礙的原因之一。

本文研究結(jié)果顯示，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠早期出現(xiàn)認知功能下降，海馬和前額葉皮質(zhì)的BDNF水平出現(xiàn)了下調(diào)。眾所周知，海馬和額葉皮質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶有著內(nèi)在的聯(lián)系，但目前尚不清楚這兩個區(qū)域的損傷是否與認知功能障礙有關(guān)。但研究表明，海馬損傷可能導(dǎo)致動物和人的空間記憶障礙[15]。另外，BDNF被認為是神經(jīng)元存活的主要調(diào)節(jié)因子[1618]，BDNF基因的變化也與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病有關(guān)[1921]。

[HJ2mm]

BDNF是維持神經(jīng)元完整性和促進神經(jīng)細胞生長與分化的重要調(diào)節(jié)因子，其主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)[2223]。另外，BDNF還有修復(fù)受損神經(jīng)元，調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸功能以及參與學(xué)習(xí)記憶的功能[24]。BDNF不僅在神經(jīng)膠質(zhì)細胞和DA能神經(jīng)元中廣泛分布，并且也分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他神經(jīng)元中[2526]。本文研究結(jié)果顯示，海馬和前額葉的BDNF水平均下調(diào)，這可能是A53T轉(zhuǎn)基因小鼠認知能力下降的一個原因。有研究結(jié)果表明，

在黑質(zhì)區(qū)中正常濃度的α突觸核蛋白可以同步提

[LL]高BDNF的水平，但在黑質(zhì)中過度表達的α突觸核蛋白卻能下調(diào)BDNF的水平，這表明BDNF水平的下降也可能與突變型A53T小鼠α突觸核蛋白的聚集有關(guān)[11，2728]。還有研究顯示，老年鼠和AD病人海馬中BDNF表達均出現(xiàn)了下調(diào)[2930]。另外，有研究在其他腦區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了BDNF水平的改變，MOGI等[31]應(yīng)用ELISA技術(shù)研究顯示，PD病人黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元分布區(qū)的BDNF水平明顯低于正常對照組，BDNF濃度的改變可能與PD的發(fā)病有著某種關(guān)聯(lián)。另有研究發(fā)現(xiàn)，杏仁核是識別和調(diào)節(jié)情緒的腦區(qū)，也與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)，杏仁核內(nèi)BDNF的下調(diào)也與抑郁癥等相關(guān)[32]。但本研究中并未涉及其他腦區(qū)內(nèi)BDNF水平的變化，有待今后進一步研究。

綜上所述，在PD早期會出現(xiàn)認知功能障礙等非運動癥狀，且非運動癥狀會早于運動癥狀發(fā)生。在PD早期非運動癥狀中，認知功能障礙是最容易被發(fā)現(xiàn)的，但目前并不清楚出現(xiàn)認知功能障礙的確切原因。認知能力的下降可能是早期PD海馬功能受損和腦相關(guān)區(qū)域BDNF水平下降所致。如能在運動癥狀出現(xiàn)之前及時診斷PD并進行干預(yù)，可減輕PD病人的痛苦。本文結(jié)果也為治療PD病人認知功能障礙提供了一個有效的靶點。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）