徐碩 金鵬飛

中圖分類(lèi)號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）05-0607-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.08

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5含量的方法。方法：采用高效液相色譜法對(duì)2家企業(yè)共8批次樣品進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱為Waters XBridge C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm（維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6）、210 nm（維生素B5），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為41.66～208.3、127.0～635.0、40.74～203.7、22.72～113.6 μg/mL（r均為0.999 9）；定量限分別為0.267、0.274、0.062、0.124 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.095、0.088、0.021、0.039 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2.0%（n=6）；平均加樣回收率分別為98.70%（RSD=0.69%，n=9）、99.74%（RSD=1.2%，n=9）、99.89%（RSD=1.0%，n=9）、99.25%（RSD=1.2%，n=9）。測(cè)定的8批樣品中，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5含量分別為標(biāo)示量的91.44%～98.74%、36.68%～95.23%、92.42%～97.90%、91.36%～99.48%，其中硫酸雙肼屈嗪的含量差異較大，最低值與最高值間相差2.6倍。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便，可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中上述4種成分的含量。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；復(fù)方羅布麻片Ⅰ；維生素B1；硫酸雙肼屈嗪；維生素B6；維生素B5；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of vitamin B1， dihydralazine sulfate， vitamin B6 and vitamin B5 in Compound Apocynum venetum tabletsⅠ. METHODS： HPLC method was used for content determination of 8 batches of samples from 2 enterprises. The determination was performed on Waters XBridge C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelengths were set at 285 nm （vitamin B1， dihydralazine sulfate， vitamin B6） and 210 nm （vitamin B5）. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of vitamin B1， dihydralazine sulfate， vitamin B6 and vitamin B5 were 41.66-208.3 μg/mL （r=0.999 9）， 127.0-635.0 μg/mL （r=0.999 9）， 40.74-203.7 μg/mL （r=0.999 9） and 22.72-113.6 μg/mL （r=0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 0.267， 0.274， 0.062， 0.124 μg/mL， respectively. The limits of detection were 0.095， 0.088， 0.021， 0.039 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The average recoveries were 98.70% （RSD=0.69%， n=9）， 99.74% （RSD=1.2%， n=9）， 99.89% （RSD=1.0%， n=9）， 99.25% （RSD=1.2%， n=9）， respectively. Among 8 batches of samples， the contents of vitamin B1， dihydralazine sulfate， vitamin B6 and vitamin B5 were 91.44%-98.74%， 36.68%-95.23%， 92.42%-97.90%， 91.36%-99.48% of labelled amount， respectively. The contents of dihydralazine sulfate were significantly different and differed by 2.6 times between the lowest and the highest threshold value. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable， simple and can be used for simultaneous determination of the above 4 components in Compound A. venetum tabletsⅠ.

KEYWORDS HPLC； Compound Apocynum venetum tabletsⅠ； Vitamin B1； Dihydralazine sulfate； Vitamin B6； Vitamin B5； Content

復(fù)方羅布麻片Ⅰ是由羅布麻葉、野菊花、防己、硫酸雙肼屈嗪、氫氯噻嗪、鹽酸異丙嗪、維生素B1、維生素B6和維生素B5組成的中西藥復(fù)方制劑，臨床用于治療高血壓[1-3]?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)其中的氫氯噻嗪進(jìn)行了含量測(cè)定[4]，而對(duì)處方中其他活性成分的含量沒(méi)有規(guī)定，顯然不能有效地控制該藥品的質(zhì)量。

復(fù)方羅布麻片Ⅰ中的化學(xué)成分較為復(fù)雜。本研究在樣品提取方法摸索過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方羅布麻片Ⅰ中各成分之間的極性、理化性質(zhì)和色譜行為差異較大，在處方中所含的6種化學(xué)藥成分中，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5的極性較高，采用同一種提取方法無(wú)法從樣品中將這4種化學(xué)藥成分與其他2種化學(xué)藥成分和中藥活性成分提取完全，難以同時(shí)進(jìn)行定量分析，因此需要建立一種可以同時(shí)對(duì)這4種高極性成分進(jìn)行含量測(cè)定的方法?，F(xiàn)有關(guān)于復(fù)方羅布麻片Ⅰ中6種化學(xué)藥成分的含量測(cè)定的文獻(xiàn)中，多數(shù)只測(cè)定了其中的1～3種成分[5-11]，尚未見(jiàn)對(duì)維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5 4種成分同時(shí)進(jìn)行定量分析的報(bào)道。

本研究采用高效液相色譜（HPLC）法，建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5 4種成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260 HPLC儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；XP205十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-800KDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方羅布麻片Ⅰ（山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：F160805、D161206、D160510、D160904、D160604；亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：160631、160128、150504，規(guī)格：每片均含維生素B1 0.5 mg、維生素B6 0.5 mg、維生素B5 0.25 mg、硫酸雙肼屈嗪1.6 mg）；維生素B1對(duì)照品（批號(hào)：15H0279，純度：99%）、維生素B6對(duì)照品（批號(hào)：15H0278，純度：99%）、維生素B5對(duì)照品（批號(hào)：35H0772，純度：99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；硫酸雙肼屈嗪對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100514- 200301，純度：100%）；乙腈和磷酸為色譜純；試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%→3%A；5～10 min，3%A；10～16 min，3%→4%A；16～20 min，4%→5%A；20～23 min，5%→10%A；23～43 min，10%A）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm（維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6的保留時(shí)間分別為6.29、7.55、13.78 min）、210 nm（維生素B5的保留時(shí)間為30.28 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5對(duì)照品41.66、127、40.74、22.72 mg，置于50 mL量瓶中，加入0.8%磷酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5質(zhì)量濃度分別為833.2、2 540、814.8、454.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方羅布麻片Ⅰ20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取粉末適量（約相當(dāng)于維生素B1與維生素B6各2 mg，硫酸雙肼屈嗪6.4 mg，維生素B5 1 mg），置于25 mL量瓶中，加入0.8%磷酸溶液15 mL，振搖2 min，超聲（功率：800 W，頻率：40 kHz）45 min，加入0.8%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 依據(jù)復(fù)方羅布麻片Ⅰ說(shuō)明書(shū)（山西云鵬制藥有限公司）提供的配方，制備不含維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5這4種待測(cè)成分的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣分析，考察樣品中其他成分和輔料對(duì)待測(cè)成分色譜峰是否有干擾。在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，4種待測(cè)成分的理論板數(shù)以維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5計(jì)均大于9 400，樣品中4種待測(cè)成分色譜峰與相鄰峰的分離度大于1.5，表明樣品中的其他成分及輔料不干擾維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5的測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.5、4、5、6、12.5 mL，分別置于50 mL量瓶中，加入0.8%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，獲得一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，?g/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，計(jì)算定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，計(jì)算檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5峰面積的RSD分別為0.31%、0.24%、0.15%、0.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：F160805）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5峰面積的RSD分別為0.43%、0.69%、0.34%、0.72%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：F160805）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5含量的RSD分別為1.3%、1.6%、0.97%、1.1%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)知含量的同一批樣品（批號(hào)：F160805），研細(xì)，精密稱取9份，分成3組，每組3份，各組分別加入對(duì)照品溶液適量（分別相當(dāng)于樣品中各被測(cè)成分含量的80%、100%、120%），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各被測(cè)成分的回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取8批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)各成分在流動(dòng)相中的紫外吸收譜圖來(lái)確定檢測(cè)波長(zhǎng)。維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6分別在246、274、292 nm處有最大吸收，兼顧3種成分在樣品色譜圖中的響應(yīng)值，綜合考慮，最終選擇285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。維生素B5僅在194 nm有末端吸收，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了采用乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.5%磷酸溶液、乙腈-50 mmol/L 磷酸二氫銨（含0.04%辛烷磺酸鈉，磷酸調(diào)至pH 3.0）為流動(dòng)相對(duì)4種成分的影響，結(jié)果顯示用乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.5%磷酸溶液時(shí)的效果較好且基本一致，故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相。文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于維生素B6、維生素B1、硫酸雙肼屈嗪的含量測(cè)定，均采用含有離子對(duì)試劑的流動(dòng)相[5，10-11]，長(zhǎng)期運(yùn)行會(huì)對(duì)液相系統(tǒng)和色譜柱造成損害。本研究使用的流動(dòng)相不需離子對(duì)試劑，結(jié)果顯示各待測(cè)成分色譜峰峰形及理論板數(shù)良好。本研究考察了不同梯度洗脫程序、不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）、不同進(jìn)樣體積（5、10、20 μL）、不同柱溫（25、30、35 ℃）下對(duì)色譜分離效果的影響，結(jié)果顯示，在最終確定的色譜條件下，4種成分的理論板數(shù)以維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5計(jì)均大于9 400，待測(cè)成分峰間以及與樣品中其他成分峰、輔料峰之間的分離度良好。

3.3 提取方法的選擇

待測(cè)成分中硫酸雙肼屈嗪在酸性水溶液中溶解度較好且較穩(wěn)定，其他成分均在水中易溶。本研究比較了分別采用乙腈-0.2%磷酸溶液（1 ∶ 4）、0.2%磷酸溶液、0.8%磷酸溶液作為提取溶劑對(duì)4種成分的影響，結(jié)果顯示用0.8%磷酸溶液提取時(shí)，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5的回收率為98%～101%，而用乙腈-0.2%磷酸溶液（1 ∶ 4）、0.2%磷酸溶液提取時(shí)4種成分的回收率分別為79%～83%、91%～95%，表明采用0.8%磷酸溶液可以將4種成分提取完全，故確定其為最終的提取溶劑。本研究比較了不同超聲提取時(shí)間（25、45、60 min）對(duì)4種成分的影響，結(jié)果顯示，超聲時(shí)間為45、60 min時(shí)對(duì)各成分的提取率無(wú)明顯差異，故確定45 min作為最終提取時(shí)間。本研究還比較了加提取溶劑將供試品溶液配制成不同質(zhì)量濃度（約24、12、6 mg/mL）時(shí)對(duì)4種成分的影響，結(jié)果顯示，溶液質(zhì)量濃度約為24 mg/mL時(shí)各成分的響應(yīng)值合適。

3.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

測(cè)定的8批樣品中，維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5含量分別為標(biāo)示量的91.44%～98.74%、36.68%～95.23%、92.42%～97.90%、91.36%～99.48%，其中硫酸雙肼屈嗪的含量差異較大，最低值與最高值間相差2.6倍。筆者經(jīng)實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，目前市售的復(fù)方羅布麻片Ⅰ均為山西云鵬制藥有限公司與亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，因此本研究收集的樣品具有一定的代表性。建議在今后標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加對(duì)維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6、維生素B5的含量的規(guī)定，從而更有利于該藥品的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本研究的方法學(xué)驗(yàn)證參照國(guó)際通行的人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議方法學(xué)驗(yàn)證原則[12-13]進(jìn)行，結(jié)果表明，建立的分析方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便，可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、維生素B6和維生素B5的含量。

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（收稿日期：2017-11-08 修回日期：2018-01-10）

（編輯：余慶華）