俞發(fā)榮，陳望軍，王春梅，謝明仁，連秀珍，李登樓，楊博，郭蘊(yùn)萱

（甘肅政法學(xué)院，甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

當(dāng)人體受到外界環(huán)境壓力刺激時(shí)，刺激信號(hào)通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸,使交感神經(jīng)興奮，促進(jìn)去甲腎上腺素、腎上腺素的分泌。去甲腎上腺素、腎上腺素作用于神經(jīng)細(xì)胞膜受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，催化腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成環(huán)-磷酸腺苷（cAMP），cAMP激活蛋白激酶A（PKA），繼而發(fā)生細(xì)胞反應(yīng)，引起神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的快速反應(yīng)基因（c-fos）和熱休克蛋白-70（Hsp-70）的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)c-fos和Hsp-70表達(dá)量可分析判斷應(yīng)激損傷的程度。本文用低頻電刺激作為應(yīng)激刺激原，利血平作為干預(yù)措施，觀察利血平對(duì)低頻電刺激引起的應(yīng)激的影響，為進(jìn)一步研究預(yù)防應(yīng)激損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，30只，體重（190±5）g[甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （甘）2015-0001]；實(shí)驗(yàn)環(huán)境：SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)：SYXK （甘）2015-0006]。

2 儀器和試劑

Dossy-2H電生理參儀（成都達(dá)碩生物科技有限公司）； MK3-酶標(biāo)儀（上海儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；Olympus生物顯微鏡（上海賴氏電子科技有限公司）；ZQP-86型振動(dòng)切片機(jī)（上海之信儀器有限公司）；c-fos和Hsp-70 免疫組織化學(xué)試劑盒、ELISA試劑盒（博士德生物科技有限公司）；利血平（廣東邦民制藥廠有限公司）。

3 低頻電刺激

全部動(dòng)物在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC飼育籠內(nèi)飼養(yǎng)（籠內(nèi)溫度23℃±1℃，濕度55%），適應(yīng)7d。隨機(jī)將動(dòng)物分為對(duì)照組：自由飲水、取食，不給電刺激；電刺激組：給予電刺激（頻率30 Hz，電流強(qiáng)度5 mA，電壓8V，脈沖寬度0.3ms，每次刺激3s，連續(xù)刺激3次），自由飲水、取食;利血平組：按利血平半數(shù)致死量（LD50）的1/100（用無(wú)菌水配制，2mg/100ml），灌胃（2ml/100g體重），次日給予電刺激（同電刺激組）。每組10只大鼠。

4 腦組織采集和檢測(cè)

動(dòng)物電刺激后90min，用乙醚吸入麻醉，無(wú)痛打開顱腔，取腦，放入含4%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）固定液固定24h，參照大鼠腦立體定位圖譜[1]，切取大腦前額葉皮質(zhì)（PFC）、中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）、海馬（Hipp）組織用振動(dòng)切片機(jī)切片，片厚10μm。切片按免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作，顯色后在顯微鏡下觀察、照相；再稱取上述腦組織各5mg，研磨成勻漿，3000 r/min離心20min，取上清分別按ELISA試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)腦組織中Hsp-70、c-fos表達(dá)水平。對(duì)照組動(dòng)物腦組織采集和檢測(cè)方法相同。

5 直線回歸方程制作

分別以Hsp-70、c-fos標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（OD）為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，將檢測(cè)腦組織樣本OD值代入直線回歸方程，計(jì)算出相應(yīng)的濃度。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。電刺激對(duì)Hsp-70、c-fos表達(dá)水平的影響程度用百分比表示,組間差異用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 低頻電刺激對(duì)腦組織中Hsp-70表達(dá)的影響

ELISA法檢測(cè)，給予Wistar大鼠電刺激后，大腦額葉皮質(zhì)Hsp-70水平比對(duì)照組升高1116.67%，中腦腹側(cè)背蓋區(qū)Hsp-70水平比對(duì)照組升高1105.24%，海馬Hsp-70水平比對(duì)照組升高1013.76%；給予利血平后再給予低頻電刺激，Hsp-70水平比對(duì)照組有所升高，但顯著低于電刺激組（圖1）。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，電刺激組大腦額葉皮質(zhì)（PFC）、中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）、海馬（Hipp）中Hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組顯著增多，利血平組上述3個(gè)腦區(qū)中Hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組高，但低于電刺激組（圖2）。

2 低頻電刺激對(duì)腦組織中c-fos表達(dá)的影響

ELISA法檢測(cè)顯示，大腦額葉皮質(zhì)c-fos水平（14.39±2.36）比對(duì)照組（2.69±0.22）升高434.94%，中腦腹側(cè)背蓋區(qū)c-fos水平（26.42±5.31）比對(duì)照組（5.09±0.34）升高419.06%；海馬c-fos水平（27.30±6.17）比對(duì)照組（5.89±0.41）升高363.49%，給予利血平后再給予低頻電刺激，c-fos水平比對(duì)照組有所升高，但比電刺激組低（圖3）。

圖2 電刺激對(duì)大鼠腦組織Hsp-70表達(dá)的影響。比例尺： PFC，20μm；VTA， 10μm；Hipp， 20μmFig.2 Effect of electrical stimulation on HSP-70 expression in rat brain tissues.Scale bar∶ PFC, 20μm; VTA, 10μm; Hipp, 20μm

圖3 電刺激對(duì)大鼠腦組織c-fos水平的影響。與對(duì)照組比，*，P＜0.05,**，P＜0.01Fig.3 Effects of electrical stimulation on c-fos level in rat brain tissue.*,P＜0.05,**, P＜0.01 vs control group

免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，電刺激組大腦額葉皮質(zhì)（PFC）、中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）、海馬（Hipp）中c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組顯著增多，利血平組上述3個(gè)腦區(qū)中c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比電刺激組明顯減少(圖 4)。

討 論

突發(fā)性死亡是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)外界刺激引起立即早期基因（如c-fos）和Hsp-70等基因表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，以期從基因水平探索突發(fā)性死亡的機(jī)制，尋找新的防治方法和措施，為臨床預(yù)防和救治應(yīng)激損傷提供參考。c-fos基因是存在于正常神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的快速反應(yīng)基因，是聯(lián)系細(xì)胞生化改變與細(xì)胞對(duì)刺激發(fā)生特異性反應(yīng)的中介物，又稱為第三信使[2]。cfos基因的表達(dá)產(chǎn)物c-fos蛋白被作為神經(jīng)元活動(dòng)變化和傷害性的標(biāo)志。麻醉劑使大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)c-fos蛋白顯著增加[3]，艾灸使小鼠大腦皮層、海馬組織cfos蛋白的表達(dá)明顯升高[4]。機(jī)體缺水[5]、缺氧[6]、缺血[7]或受磁刺激[8]、電刺激后c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)[9]。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境因素刺激時(shí)，Hsp-70迅速大量合成，與細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白結(jié)合，幫助變性蛋白恢復(fù)或?qū)⒆冃缘鞍走\(yùn)送到溶酶體降解，起到細(xì)胞自身保護(hù)作用[10]。近年的研究顯示，生理和情緒應(yīng)激與Hsp-70的表達(dá)關(guān)系密切，心理生理性應(yīng)激可以誘導(dǎo)大鼠海馬組織Hsp-70表達(dá)[11]，針療[12]、電刺激[13]、腦組織缺血[14]、冷[15]、熱[16]刺激、化學(xué)試劑[17]、重金屬[18]等均可引起Hsp-70 的合成和釋放。Hsp-70不僅具有顯著的神經(jīng)保護(hù)活性，而且參與γ-氨基丁酸（GABA，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)）的調(diào)節(jié)過(guò)程，從而維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮-抑制平衡。利血平屬于腎上腺素能神經(jīng)抑制劑，能阻斷神經(jīng)末梢內(nèi)囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的形成，使突觸前神經(jīng)末梢產(chǎn)生的去甲腎上腺素等物質(zhì)在未受保護(hù)的情況下被細(xì)胞質(zhì)中的單胺氧化酶（MAO）、兒茶酚鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）代謝耗竭，使交感－腎上腺髓質(zhì)軸的興奮降低，緩解了應(yīng)激損傷程度，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用[19]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予大鼠低頻電刺激，大鼠腦組織中Hsp-70和c-fos水平顯著升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，說(shuō)明低頻電刺激可引起應(yīng)激，并通過(guò)上調(diào)Hsp-70和c-fos水平以產(chǎn)生保護(hù)作用。先給予利血平，再給予低頻電刺激，大鼠腦組織中Hsp-70和c-fos水平比單給電刺激組顯著降低，表明利血平干預(yù)低頻電刺激對(duì)腦組織應(yīng)激損傷的作用是通過(guò)降低或耗竭去甲腎上腺素等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，去甲腎上腺素參與應(yīng)激損傷過(guò)程[20]。

圖4 電刺激對(duì)大鼠腦組織c-fos表達(dá)的影響。比例尺：PFC, 10μm；VTA, 10μm；Hipp, 20μmFig.4 Effect of electrical stimulation on c-fos expression in rat brain tissues.Scale bar∶ PFC, 10μm; VTA, 10μm; Hipp, 20μm

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