李明顯，杜志華，何青蓮，李曉，何麗斯，鄭廣娟

（廣東省中醫(yī)院病理科，廣州，510120）

常規(guī)石蠟切片過(guò)程中，傳統(tǒng)的撈片操作只需將組織切片粘貼于載玻片的適當(dāng)位置即可，并沒(méi)有對(duì)組織的方向和具體位置做明確要求，因此，同一組織蠟塊制得的多張連續(xù)切片的組織之間存在不同的角度及位置差異，制片效果在一定程度上降低了病理醫(yī)生閱片的工作效率。 嚴(yán)格規(guī)范地限定切片上的組織方向和相對(duì)位置就可以使連續(xù)切片的制片效果趨于一致，進(jìn)而可以提高病理醫(yī)生閱片的工作效率。通過(guò)對(duì)包埋模具和載玻片進(jìn)行改進(jìn)，并按照相應(yīng)的操作規(guī)則就能使同一組織蠟塊的多張連續(xù)切片在載玻片上的粘貼方向相對(duì)統(tǒng)一、粘貼位置相對(duì)固定，將這種方法應(yīng)用于免疫組化和特殊染色等技術(shù)的切片制作可以使病理醫(yī)生的閱片工作更加便利。

材料與方法

1 材料

標(biāo)本來(lái)源于廣東省中醫(yī)院臨床科室送檢的闌尾、膽囊和腸壁等小組織。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

常規(guī)石蠟切片包埋模具（20mm×20mm、江蘇世泰），載玻片（25mm×75mm、江蘇世泰），石蠟包埋機(jī)（Thermo，美國(guó)），石蠟切片機(jī)（Leica，德國(guó)），攤片機(jī)（Leica，德國(guó)），顯微鏡（OLYMPUS BX51，日本）

3 實(shí)驗(yàn)分組與方法

對(duì)照組和改進(jìn)組均包含闌尾，膽囊和腸壁小組織各一例。

傳統(tǒng)方法：將脫水完成的標(biāo)本分別用包埋模具進(jìn)行石蠟包埋（圖1A1），并對(duì)制作好的組織蠟塊進(jìn)行石蠟切片，將切得的多張連續(xù)合格的石蠟切片放入攤片池內(nèi)，然后將展平的組織切片分別撈至載玻片上（圖1B1），該組作為對(duì)照組。每例標(biāo)本制作36張切片并依次編號(hào)，烤片后進(jìn)行HE染色。

改進(jìn)方法：將脫水完成的標(biāo)本分別用改進(jìn)包埋模具進(jìn)行石蠟包埋（圖1A2），并對(duì)制作好的組織蠟塊進(jìn)行石蠟切片，將切得的多張連續(xù)合格的具有缺角標(biāo)記的石蠟切片放入攤片池內(nèi)，在載玻片上標(biāo)記多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)“T”字符號(hào)，等距離分布在載玻片長(zhǎng)邊的兩側(cè)。撈片時(shí)，根據(jù)組織切片的缺角標(biāo)記統(tǒng)一組織切片在載玻片上的粘貼方向，固定以某一“T”字符號(hào)作為參照物，然后將展平的組織切片分別撈至載玻片上（圖1B2），該組作為改進(jìn)組。每例標(biāo)本制作36張切片并依次編號(hào)，烤片后進(jìn)行HE染色。

分別選取每例標(biāo)本的第一張切片在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，在低倍鏡下選擇目標(biāo)區(qū)域后記錄切片的位置并固定顯微鏡的切片夾，然后依次對(duì)每例標(biāo)本的其余切片進(jìn)行觀(guān)察，并記錄目標(biāo)區(qū)域定位所消耗的時(shí)間（即目標(biāo)區(qū)域定位耗時(shí)），及相對(duì)于第一張切片的方向和位置關(guān)系。

圖1 包埋模具和載玻片改進(jìn)前后的示意圖。A1，傳統(tǒng)包埋模具示意圖；A2，改進(jìn)包埋模具示意圖；B1，傳統(tǒng)載玻片示意圖；B2，改進(jìn)載玻片示意圖Fig 1.Illustration of the embedding mold and mounting slide before and after improvement.A1, conventional embedding mold; A2, improved embedding mold; B1, conventional slide; B2, slide after improvement

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，粘貼方向、粘貼位置及目標(biāo)區(qū)域定位的耗時(shí)差異在組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

為了明確在HE染色技術(shù)中改進(jìn)包埋模具和改進(jìn)載玻片的使用規(guī)則能否制作標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的HE切片，我們記錄了每例組織的HE染色切片相對(duì)于第一張切片的角度和位置差異（圖2），以及在低倍顯微鏡下定位同一組織相同目標(biāo)區(qū)域（圖3）所消耗的時(shí)間（即目標(biāo)區(qū)域定位耗時(shí)）。結(jié)果顯示：與同組第一張切片相比，改進(jìn)組的切片方向和粘貼位置均完全吻合，符合率均為100%，而對(duì)照組的切片方向和粘貼位置符合率均顯著低于改進(jìn)組。此外，改進(jìn)組在低倍顯微鏡下定位同一組織相同目標(biāo)區(qū)域的耗時(shí)均顯著低于對(duì)照組（表1）。這些結(jié)果提示改進(jìn)后的包埋模具和改進(jìn)后的載玻片使用規(guī)則不但能夠滿(mǎn)足病理醫(yī)生對(duì)切片的制作要求，而且能夠顯著提高病理醫(yī)生閱片的工作效率，可以更好地服務(wù)于臨床病理診斷。

討 論

常規(guī)石蠟包埋HE染色切片質(zhì)量的基本標(biāo)準(zhǔn)[1]中沒(méi)有對(duì)組織的方向和具體位置做明確要求，其他病理技術(shù)切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也缺乏具體的規(guī)范要求，而制片效果在一定程度上會(huì)影響病理醫(yī)生閱片的工作效率。尤其是應(yīng)用免疫組化技術(shù)[2,3]對(duì)乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及甲狀腺微小乳頭狀癌進(jìn)行診斷時(shí)，及應(yīng)用特殊染色技術(shù)對(duì)腎臟穿刺組織進(jìn)行診斷時(shí)，病理醫(yī)生需要對(duì)顯微鏡上的切片進(jìn)行前后左右地不斷調(diào)整，必要時(shí)會(huì)在載玻片上進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記以方便再次觀(guān)察，而標(biāo)記后的蓋玻片若發(fā)生移位或標(biāo)記符號(hào)變淡或被擦除，都會(huì)造成標(biāo)記失敗。

圖2 傳統(tǒng)方法和改進(jìn)方法制片效果比較。A1-A3，分別顯示闌尾組織，膽囊組織和腸壁小組織應(yīng)用傳統(tǒng)方法的HE染色制片效果；B1-B3，分別顯示闌尾、膽囊和腸壁應(yīng)用改進(jìn)方法的HE染色制片效果Fig.2 Comparison of slides prepared by conventional or new methods.A1 to A3, HE-staining of appendix, gallbladder and intestinal wall tissue slices prepared using conventional approach; B1 to B3, HE-staining of same tissue slices prepared using new method.

表1 對(duì)照組與改進(jìn)組三種組織HE染色制片效果比較Tab.1 Comparison on the HE stain of three different tissue slices prepared by conventional and new methods

圖3 傳統(tǒng)方法和改進(jìn)方法所制切片的HE染色顯微圖像比較。A1-A3，分別顯示闌尾，膽囊和腸壁應(yīng)用傳統(tǒng)方法的HE染色效果；B1～B3，分別顯示闌尾、膽囊、和腸壁應(yīng)用改進(jìn)方法的HE染色效果；比例尺，300μm；箭頭示目標(biāo)區(qū)域Fig.3 Comparison of HE-stained slides prepared by conventional and new methods.Images for HE-stained appendix (1), gallbladder (2) and intestinal wall (3).Slides A1-3 were prepared using conventional method and B1-3 by new method.Arrows pointed to the target areas.Scale bar, 300μm

為了滿(mǎn)足病理醫(yī)生對(duì)切片制作的要求，尤其是同一組織蠟塊進(jìn)行多張連續(xù)的免疫組化切片制作時(shí)，撈片過(guò)程中技術(shù)員通常會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)統(tǒng)一組織切片的方向及粘貼位置，使制作的切片趨于規(guī)范一致。由于組織切片在水面上呈透明狀態(tài)，而且組織切片很容易在水面上發(fā)生旋轉(zhuǎn)和漂移，又由于載玻片上缺少明確的參照物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：應(yīng)用傳統(tǒng)方法同一組織蠟塊制得的多張連續(xù)切片容易形成0～180°的角度差異和不同的相對(duì)位置移動(dòng)，形狀規(guī)則的膽囊組織制片效果差異較小，而較小的腸壁小組織制片效果差異更明顯。組織切片在缺少明顯標(biāo)記的情況下，其方向辨識(shí)和位置判斷比較困難，雖然通過(guò)對(duì)組織蠟塊削角處理可以使組織切片上均呈現(xiàn)明顯相同的標(biāo)記部位，但是不規(guī)范的削角操作可能會(huì)影響切片質(zhì)量及制片效果，因此，僅憑借個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行撈片操作是無(wú)法制作標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的切片[4]。

圖4 改進(jìn)方法在免疫組織化學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用。A，乳腺癌組織應(yīng)用改進(jìn)方法的免疫組織化學(xué)染色效果；B1-B8，分別顯示乳腺癌組織SMMHC、GATA-3、P120、E-Cadherin、Ki-67、CerbB2、PR、ERa的免疫組織化學(xué)染色顯微攝影效果；B1細(xì)胞質(zhì)染色陰性，B2、B5、B7、B8細(xì)胞核染色陽(yáng)性，B3和B4細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)染色陽(yáng)性，B6細(xì)胞膜染色陽(yáng)性；比例尺，300μmFig.4 Application of new method in IHC techniques.A, IHC staining of breast cancer tissue with new method.Microscopic images of IHC stained breast cancer tissues∶ B1) SMMHC; B2) GATA-3; B3) P120; B4) E-Cadherin; B5) Ki-67; B6) CerbB2; B7) PR and B8) ERa.Negative cytoplasm stain in B1 and positive nuclear stain in B2, B5, B7 and B8; Positive cell membrane and cytoplasm stain in B3 and B4; Positive cell membrane stain in B6;scale bar, 300μm

改進(jìn)方法通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)包埋模具進(jìn)行缺角設(shè)計(jì)，利用改進(jìn)包埋模具進(jìn)行石蠟包埋時(shí)，無(wú)需額外的操作就能使制作出的每個(gè)組織蠟塊均具有明顯的缺角結(jié)構(gòu)，對(duì)該組織蠟塊進(jìn)行切片后也能得到具有明顯缺角標(biāo)記的組織切片，進(jìn)而能夠較容易地統(tǒng)一同一組織多張連續(xù)切片的方向；改進(jìn)方法在載玻片上設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的“T”字符號(hào)為組織切片的粘貼位置提供清晰準(zhǔn)確的參照物，固定以某一“T”字符號(hào)作為參照物，就能使同一組織的多張連續(xù)切片在載玻片上的粘貼位置相對(duì)固定。本實(shí)驗(yàn)用兩種不同的方法對(duì)同一組織蠟塊的多張連續(xù)切片進(jìn)行HE染色切片制作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不管組織形狀是否規(guī)則，或者大小如何，按照改進(jìn)方法的操作規(guī)則進(jìn)行制片，同一組織的多張連續(xù)切片都能達(dá)到粘貼方向相對(duì)統(tǒng)一，粘貼位置相對(duì)固定的制片效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證改進(jìn)方法在實(shí)際工作中的應(yīng)用效果，對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行了免疫組化染色切片制作（圖4），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用改進(jìn)方法的免疫組化切片制片效果同樣具有粘貼方向相對(duì)統(tǒng)一，粘貼位置相對(duì)固定的特點(diǎn)，同理，改進(jìn)方法應(yīng)用于特殊染色技術(shù)同樣能得到相同的制片效果。因此將改進(jìn)方法應(yīng)用于同一組織進(jìn)行多張連續(xù)切片的病理技術(shù)中，病理醫(yī)生在顯微鏡下對(duì)第一張切片的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行定位后，其余切片均只需要更換至第一張切片的相同位置就能在相同的視野內(nèi)得到目標(biāo)區(qū)域，從而可以對(duì)相應(yīng)切片做出快速判斷，極大得節(jié)省了病理醫(yī)生的時(shí)間和精力，而且該優(yōu)點(diǎn)的發(fā)揮不限醫(yī)院、不限醫(yī)生、不限顯微鏡、不限組織、不限染色方法。若要達(dá)到預(yù)期的制片效果，還需注意以下幾點(diǎn)：①載玻片上的“T”字符號(hào)要規(guī)范統(tǒng)一，同時(shí)載玻片需具有一定的粘附性，防止撈片及烤片過(guò)程中組織在載玻片上發(fā)生位置移動(dòng)。②撈片動(dòng)作要迅速，防止含較多脂肪的組織切片因停留在溫水中的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而發(fā)生膨脹，進(jìn)而改變組織切片中作為參照物的形狀結(jié)構(gòu)。在改進(jìn)方法操作規(guī)則的基礎(chǔ)上，撈片時(shí)若能進(jìn)一步統(tǒng)一不同組織切片的缺角方向，對(duì)任一組織蠟塊而言，無(wú)論是一次制得多張連續(xù)切片，還是以后多次制片，即使在沒(méi)有該組織蠟塊的第一次切片可供參考的情況下，按照改進(jìn)方法的操作規(guī)則也能較容易地制作出與第一次的制片效果具有相同的粘貼方向和粘貼位置的切片，而且可以與第一次切片中的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性、定量比較，為準(zhǔn)確的病理診斷提供依據(jù)。

包埋模具的缺角設(shè)計(jì)與載玻片的“T”字符號(hào)相結(jié)合使制作標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的切片更加容易，與傳統(tǒng)方法相比，改進(jìn)方法并沒(méi)改變技術(shù)員的工作方式，也沒(méi)有增加技術(shù)員的工作量。當(dāng)同一組織蠟塊需要進(jìn)行多張連續(xù)切片的免疫組化或特殊染色（尤其是腎臟穿刺組織特殊染色）時(shí)，應(yīng)用改進(jìn)方法不但能夠滿(mǎn)足病理醫(yī)生對(duì)切片制作的要求，而且可以提高病理醫(yī)生閱片的工作效率,是一種值得推廣的新型技術(shù)方法。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范-病理學(xué)分冊(cè).北京：人民軍醫(yī)出版社，2004，6.

[2]張璋，唐平.免疫組化在乳腺病理診斷中的應(yīng)用.診斷病理學(xué)雜志，2018，25（4）：311-315.

[3]張衛(wèi)琴.免疫組化技術(shù)在病理診斷中的應(yīng)用.安徽醫(yī)藥，2012，16（11）：1700-1702.

[4]張曉婷，楊佩濃.影響病理切片制作的常見(jiàn)因素分析.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2017，33（6）：698-699.