劉 暢，孔令鈺，李 楠，楊 萍

(天津市醫(yī)藥科學研究所，天津 300020)

我國有數量龐大的糖尿病人群，隨之而來的降糖產品需求量也很大[1]。除化學合成口服降糖藥外，普通糖尿病人對中藥和保健品也很信賴。因此，假藥生產商在其中非法添加化學合成降糖藥物，使其療效顯著以牟取利益[2-6]。格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、二甲雙胍、苯乙雙胍因療效確切、價格低廉被廣泛應用其中。而現在對降糖中藥和保健品中非法添加藥物的檢驗主要應用液質聯用的方法，雖然其專屬高效，但因為儀器設備的限制，基層藥檢部門需要更加適用的方法，本文建立更簡單、常規(guī)、普及的高效液相色譜法，可供基層食品藥品檢驗機構檢驗檢查，有效打擊制假行為。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀；METTLER AE240電子天平。

1.2試藥 格列美脲(批號100674-201503)、格列吡嗪(批號100281-201604)、格列本脲(批號100135-201105)、鹽酸吡格列酮(批號100634-201202)、瑞格列奈(批號100753-201303)、格列齊特(批號100269-201505)、格列喹酮(批號100280-201403)、鹽酸二甲雙胍(批號100664-201604)、鹽酸苯乙雙胍(批號100922-201001)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(DIKMA)為色譜純；其他試劑均為分析純；試驗用樣品膠囊A、膠囊B、膠囊C均于藥店及網上購買。

2 方法與結果

2.1色譜條件1(適用于格列類及其他) 色譜柱：TIANHE Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節(jié)pH值至3.0±0.05)(70∶30)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：233 nm；進樣量10 μl。以色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，以外標法峰面積定量。

2.2色譜條件2 (適用于雙胍類) 色譜柱：TIANHE Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-離子對試液(辛烷磺酸鈉0.585 6 g，加三乙胺1.4 ml，加水至1 000 ml，用磷酸調節(jié)pH值至3.5±0．05)(55∶45)；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：233 nm；進樣量10 μl。以色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，以外標法峰面積定量。

2.3溶液的制備

2.3.1對照品溶液的制備 分別精密稱取格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮適量于同一量瓶中，甲醇定容得到格列類及其他對照品儲備液，再取1 ml該儲備液，用甲醇稀釋至10 ml，得到格列類及其他對照品溶液，濃度分別為20.64、39.88、30.09、59.43、21.73、80.69和69.57 μg/ml。分別精密稱取鹽酸二甲雙胍及鹽酸苯乙雙胍適量于同一量瓶中，甲醇定容得到雙胍類對照品儲備液，再取1 ml該儲備液，用甲醇稀釋至10 ml，得到雙胍類對照品溶液，濃度為40.29 及21.52 μg/ml。

2.3.2供試品溶液的制備 取膠囊20粒，去殼，研細，將殼剪碎，內容物粉末和殼分別精密稱取0.5 g，置25 ml量瓶中，加適量甲醇，超聲處理20 min，冷卻至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4系統(tǒng)適用性試驗 取格列類及其他對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，其色譜峰流出順序依次為鹽酸吡格列酮(4.472 min)、格列吡嗪(5.907 min)、格列齊特(7.200 min)、格列本脲(12.367 min)、格列美脲(16.549 min)、瑞格列奈(18.835 min)、格列喹酮(27.598 min)，各降糖藥相鄰色譜峰分離度均大于1.5且峰對稱性較好，見圖1。取雙胍類對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件分析，其色譜峰流出順序依次為鹽酸二甲雙胍(3.828 min)、鹽酸苯乙雙胍(6.252 min)，兩種降糖藥色譜峰分離度大于1.5且峰對稱性較好，見圖2。

1.鹽酸吡格列酮 2.格列吡嗪 3.格列齊特

1.鹽酸二甲雙胍 2.鹽酸苯乙雙胍

2.5標準曲線和線性范圍 在選定的色譜條件下，取兩種對照品儲備液加甲醇稀釋成6個水平的系列對照品工作溶液進行分析。以峰面積和質量濃度作標準曲線，得到線性回歸方程，相關系數在0.999 4～0.999 9之間，表明各化合物在相應的濃度范圍內呈良好的線性關系。見表1。

2.6檢出限和定量限試驗 以對照品溶液逐步稀釋至峰高為信噪比3倍時，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍檢出限分別為0.72、0.40、0.75、0.59、0.65、0.48、0.83、0.32和0.86 μg/ml；至峰高為信噪比10倍時，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍定量限分別為2.0、1.2、2.0、1.7、1.7、1.6、2.4、1.2和2.6 μg/ml。

2.7精密度試驗 取對照品溶液，重復進樣5次，記錄色譜圖，測得峰面積。結果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍和鹽酸苯乙雙胍峰面積的RSD分別為1.20%、0.67%、1.39%、1.03%、1.00%、1.70%、1.61%、0.44%和1.87%，表明精密度較好。

表1 各降糖藥的標準曲線、相關系數和線性范圍

2.8重復性試驗 取確定不含上述化學合成降糖藥的保健品(膠囊A)，加入稀釋后的對照品儲備液，按照“2.3.2”項下方法對其進行處理，并按“2.1”和“2.2”項下色譜條件測定峰面積，重復5次，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍含量的RSD分別為2.30%、0.31%、1.63%、2.14%、1.88%、2.21%、2.07%、1.16%和2.67%，表明方法的重復性較好。

2.9穩(wěn)定性試驗 取“2.8”項下制備的樣品，在放置不同時間段(0、2、4、8、12和24 h)進樣測定，結果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍和鹽酸苯乙雙胍峰面積的RSD分別為1.86%、1.02%、0.97%、1.66%、0.76%、1.77%、1.78%、0.69%和0.83%，表明供試品溶液至少在24 h內穩(wěn)定。

2.10回收率試驗 分別精密吸取兩種對照品儲備液1、2和3 ml各3份置25 ml量瓶中，再精密加入確定不含上述化學合成降糖藥的中藥保健品(膠囊A粉末)0.5 g，加適量甲醇，超聲處理20 min，冷卻至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，測定試驗回收率。結果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齊特、格列喹酮、鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍平均回收率分別為100.8%、102.0%、99.7%、101.7%、104.3%、101.2%、98.8%、100.0%和99.5%；RSD分別為1.44%、1.17%、1.95%、1.18%、1.82%、1.05%、1.84%、1.06%和1.96%。見表2-10。

表2 格列美脲回收率試驗結果

表3 格列吡嗪回收率試驗結果

表4 格列本脲回收率試驗結果

表5 鹽酸吡格列酮回收率試驗結果

表6 瑞格列奈回收率試驗結果

表7 格列齊特回收率試驗結果

表8 格列喹酮回收率試驗結果

表9 鹽酸二甲雙胍回收率試驗結果

表10 鹽酸苯乙雙胍回收率試驗結果

2.11樣品測定 運用本文建立的方法對膠囊A、膠囊B、膠囊C三種保健品進行測定，結果表明膠囊C粉末中含有一個保留時間為12.472的峰，與保留時間為12.367的格列本脲對照品一致，其紫外吸收也一致，初步確定該樣品中含有格列本脲，含量為1.28 mg/g，其他膠囊粉末和膠囊殼中均未檢出上述化學降糖藥物。色譜圖見圖3-圖4。

1.格列本脲

圖4 格列本脲(A)及膠囊C粉末(B)的紫外光譜圖

3 討論

3.1雙胍類藥物具有較強極性，使用常規(guī)流動相沖洗，柱保留時間短，加入辛烷磺酸鈉作為離子對試劑，柱有很好的保留，而這種條件下格列類的化合物難以分離，因此建立了兩種HPLC條件。

3.2為了簡化試驗步驟并保證較高的提取效率，本文采用超聲的方式來對樣品進行提取?；瘜W降糖藥物在甲醇中均有良好的溶解性，故選擇甲醇作為溶劑。

3.3使用化學合成藥物過量時會有不同程度的不良反應，抗糖尿病藥物的不良反應主要有代謝和營養(yǎng)障礙，神經系統(tǒng)損害和胃腸系統(tǒng)的損害，磺酰脲類降糖藥的不良反應體現為胃腸道反應、低血糖、過敏反應、血液系統(tǒng)反應、肝損傷、腎損傷等[7，8]。本試驗中，初步判斷一種保健品中含有化學合成藥。在保健品中添加化學合成藥物，普通消費者會在平時長期服用該保健品過程中用藥過量，出現不良反應而不自知，或在服用過程中與某些藥物聯用，可能出現藥物的相互作用，對身體造成較大傷害。

1 黃海燕,饒偉文,鐘建理.降糖類中成藥和保健食品中非法添加化學藥品的研究概況[J].中國藥業(yè),2014,23(5):94-96

2 徐文峰,金鵬飛.降糖類中成藥和保健食品中非法添加化學藥物檢測技術的研究進展[J].中南藥學,2016,14(11):1233-1237

3 陳洪忠,鞏建華.創(chuàng)新藥品監(jiān)督抽驗理念打擊中藥制劑中非法添加化學物質的違法行為[J].齊魯藥事,2009,28(6)：324-326

4 勵炯,曹青文,王姣斐,等.基于實心核顆粒色譜技術結合HPLC法快速測定保健食品中非法添加13種降糖化學成分[J].中草藥,2017,48(13):2666-2673

5 王巍,毛慶.中成藥和保健食品中非法添加化學物質的研究進展[J].廣東化工,2016,43(22):120-121

6 董永成,杜士明,陳永順,等.中成藥及保健食品非法添加化學成分的類型、危害以及對策[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,7(8):1601-1602

7 王蘭蘭.抗糖尿病藥物所致臨床不良反應的臨床分析[J].糖尿病新世界,2015,18(2):5-6

8 王軍生.磺酰脲類降糖藥不良反應研究分析[J].中國衛(wèi)生標準管理,2015,6(21):89-90