王傳琪，肖 文，嚴(yán)麗紅，馬 瑞 ，楊曉燕*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

根際是植物自身創(chuàng)造的一種特殊環(huán)境，由植物根系包圍，并受植物根系的影響，是大量微生物和無脊椎動物的家園，被認(rèn)為是地球上最具活力的界面之一〔1〕。而在其中生存的微生物被定義為根際微生物，是根際微生物生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌三大群落〔2〕，它們在轉(zhuǎn)化土壤有機(jī)質(zhì)時，能夠釋放礦物質(zhì)，進(jìn)而對植物的原生演替產(chǎn)生促進(jìn)作用，反過來，植物以腐殖質(zhì)和根系分泌物的形式向土壤子系統(tǒng)補(bǔ)充能量，大大促進(jìn)了微生物活動，使得根際土壤微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非根際土壤〔3-4〕。目前，越來越多的研究表明，土壤微生物對于植物的生長和健康具有重要影響，但是，植物在生長和發(fā)育過程中對微生物群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的反作用尚無定論〔5〕。2015年，Guo等〔6〕采用磷脂脂肪酸分析法對海南橡膠園橡膠根際土壤和非根際土壤微生物群落的空間變化進(jìn)行了研究，通過對不同樹齡橡膠樹根際微生物群落結(jié)構(gòu)的分析研究表明，根際土壤中的總生物量明顯高于非根際土壤，并且隨著樹齡的增加，土壤微生物生物量呈逐漸上升趨勢。但2007年，王韻等〔7〕對廣西喀斯特地區(qū)不同演替階段植物根際微生物群落的研究表明，在植被恢復(fù)過程中，隨著樹齡的增加，細(xì)菌和土壤微生物總量逐漸增加，真菌則逐漸減少。為了進(jìn)一步探究植物在生長和發(fā)育過程中對微生物群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的影響，本研究以核桃根際放線菌為研究對象，結(jié)合其抑菌活性開展研究，了解不同演替階段核桃根際放線菌群落結(jié)構(gòu)特征和生態(tài)功能特征的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采集 樣品采自漾濞縣蒼山西鎮(zhèn)光明村（東經(jīng)99°58′6.816″，北緯25°40′3.216″）10棵不同樹齡核桃根際土壤，每棵核桃樹之間平均相距約700 m，取樣部位為樹冠投影內(nèi)緣，離樹干1.0 m左右，按“東南西北”4個方位，采集土樣，采集時除去核桃根部表層土壤，取5～15 cm土層的土壤約200 g，裝入封口樣品袋混勻。核桃樹齡通過走訪當(dāng)?shù)鼐用翊_定，分別為 10、20、30、40、50、100、200、260、350、500年，所有采集的樣品置4℃冰箱保存，1周內(nèi)處理完所有樣品。

1.1.2 供試病原菌 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，批號：ATCC186335）、大腸桿菌（Escherichia coli，批號：ATCC25922）、青霉菌（Penicillium，批號：ATCC117714），供試病原菌由大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 高氏一號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制方法見文

獻(xiàn)〔8-9〕。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離 將土樣取出，置于室內(nèi)風(fēng)干，充分研磨，過篩，然后分別稱取10 g土壤轉(zhuǎn)置于盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，置于45℃恒溫?fù)u床中120 r∕min振蕩24 h，使蘊(yùn)藏在樣品中的放線菌充分釋放〔10〕，溫室中靜置20 min備用。采用10倍比稀釋法將土樣懸液稀釋為10-3、10-4、10-5，分別吸取0.1 mL土壤懸液涂布到高氏一號培養(yǎng)基上，每個濃度設(shè)置3個平行，置于28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)4～7 d。挑取單菌落進(jìn)行平板劃線分離培養(yǎng)，經(jīng)過多次純化接種到高氏一號斜面培養(yǎng)基，并置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，然后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定 根據(jù)國際鏈霉菌計(jì)劃（ISP）中有關(guān)放線菌培養(yǎng)特征的標(biāo)準(zhǔn)，觀察并記錄放線菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況〔11〕。采用插片法〔12〕觀察自然狀態(tài)下基絲、氣絲、孢子絲、孢子的形態(tài)，并用微分干涉顯微鏡AE31進(jìn)行拍照，參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》鑒定到屬。

1.2.3 抑菌活性的測定 病原菌菌懸液制備：將冷凍保存的金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）劃線接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，青霉菌（Penicillium）劃線接種至PDA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落至裝有10 mL無菌PBS緩沖液的試管中，得到病原菌菌懸液，置于4℃冰箱中備用〔13〕。

放線菌發(fā)酵液制備：菌種經(jīng)斜面活化后，用接種環(huán)將菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、160 r∕min搖床培養(yǎng) 6 d，發(fā)酵結(jié)束后，8 000 r∕min 離心，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌圈直徑測定：采用濾紙片法〔14〕進(jìn)行測定。分別取金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）菌懸液100 uL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，青霉菌（Penicillium）菌懸液100 uL涂布于PDA培養(yǎng)基。取20 uL發(fā)酵液滴加于6 mm無菌濾紙片，將其分別貼于上述培養(yǎng)基上，細(xì)菌和青霉菌分別置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h和48 h后觀察有無抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 將采樣點(diǎn)土壤樣品按照樹齡分為兩組，樹齡＜100年的采樣點(diǎn)為演替早期，樹齡≥100年的采樣點(diǎn)為演替后期，使用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 放線菌分離純化結(jié)果 本研究共分離得到133株放線菌，初步鑒定為11個屬，演替早期采樣點(diǎn)共分離到83株放線菌，分布于10個屬，演替后期采樣點(diǎn)共分離到50株放線菌，分布于6個屬（表1）。其中鏈霉菌屬（Streptomyces）和間孢囊菌屬（Intra?sporangium）分布較為廣泛，在所有采樣點(diǎn)中均能分離到，原小單孢菌屬（Promicromonospora）、糖絲菌屬（Saccharopolyspora）和小雙孢菌屬（Microbispora）僅在一個采樣點(diǎn)分離到。

如表2所示，從演替早期土壤樣品中分離的放線菌屬豐富度高于演替后期（t=2.921，P=0.019），檢出率亦然（t=5.127，P=0.001）。

2.2 不同演替階段抑菌活性菌株分布 如表3所示，從演替后期土壤樣品中分離到的活性菌株數(shù)量高于演替早期（t大腸桿菌=-2.479，P=0.038；t金黃色葡萄球菌=-2.613，P=0.031；t青霉菌=-2.399，P=0.043）。

表1 不同演替階段核桃根際放線菌檢出數(shù)量

表2 不同演替階段屬豐富度和檢出率的差異

表3 不同演替階段抑菌活性菌株數(shù)量

2.3 不同演替階段菌株抑菌活性特征 如表4所示，從演替后期土壤樣品中分離到的活性菌株抑菌活性與演替早期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t大腸桿菌=-0.396，P=0.695；t金黃色葡萄球菌=0.331，P=0.743；t青霉菌=-0.225，P=0.823）。

表4 不同演替階段菌株抑菌活性

3 討論

本研究在核桃根際共分離到放線菌133株，演替早期核桃根際土壤中放線菌資源較演替后期核桃根際中多，與崔翠〔15〕研究結(jié)果基本一致，即在不同生長年限的核桃根際土壤中，土壤微生物數(shù)量及種群發(fā)生了較大的變化，放線菌種群數(shù)量隨著生長年限的增長而呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能由于生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育早期階段根系生長迅速，有助于釋放多種關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，使土壤有機(jī)質(zhì)不斷積累，為微生物的生長創(chuàng)造了良好的生長環(huán)境〔16〕，這種生態(tài)系統(tǒng)的早期轉(zhuǎn)變是基本的，通常是由植物與共生細(xì)菌之間早期的互惠關(guān)系驅(qū)動的〔17-18〕，然而，由于土壤有機(jī)質(zhì)的長期損失和根系重新分配關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，植物和根際微生物相互拮抗，物種之間對于資源的競爭加劇，最終限制了生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力〔19〕，導(dǎo)致微生物數(shù)量不斷減少。植物根際土壤微環(huán)境隨著植物生長而不斷變化，根際微生物為適應(yīng)微環(huán)境的改變而發(fā)生群落結(jié)構(gòu)的演替。

在演替過程中，隨著放線菌群落結(jié)構(gòu)的不斷變化，具有抑菌活性的放線菌數(shù)量和所抑制病原菌的種類也在不斷變化，演替后期分離得到的放線菌的數(shù)量明顯高于演替早中期，并且在不同演替階段對不同病原菌的抑制能力也不相同，這可能與植物—根系—微生物的相互作用有關(guān)。根際是受植物根系活動影響、靠近植物根系的微域土區(qū)，直接受到植物的影響〔20〕，是微生物相互作用、基因交換和群落結(jié)構(gòu)演替的關(guān)鍵區(qū)域〔21〕。研究表明，植物可以通過自身合成或從外部環(huán)境中吸收物質(zhì)，分泌到根際周圍的土壤中，通過微生物之間的競爭作用，對根際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇性塑造〔22〕，例如鏈霉菌能夠分泌嗜鐵螯合鐵離子〔23〕，從而可以利用較多的鐵離子，限制土壤其他微生物的生長。并且，根際微生物在與宿主植物的長期進(jìn)化過程中，與次級代謝產(chǎn)物生物合成有關(guān)基因可通過水平基因轉(zhuǎn)移使得植物根際放線菌產(chǎn)生一些由植物合成的生物活性物質(zhì)〔24-25〕。而核桃的有效成分大多存在于植物根部，其根際微生物長期以來受根系分泌物的影響，使得核桃根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特征存在一定特殊性〔26〕。

〔1〕PHILIPPOT L，RAAIJMAKERS J M，LEMANCEAU P，et al.Going back to the roots：the microbial ecology of the rhizo?sphere〔J〕.Nature Reviews Microbiology，2013，11（11）：789-799.

〔2〕TATE III R L.Soil microbiology〔M〕.Hoboken：John Wiley and Sons，1995.

〔3〕LYNCH J M，WHIPPS J M.Substrate flow in the rhizo?sphere〔J〕.Plant and Soil，1990，129（1）：1-10.

〔4〕張超.黃土丘陵區(qū)撂荒演替中根際微生物特性演變特征〔D〕.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

〔5〕JANGID K，WHITMAN W B，CONDRON L M，et al.Soil bacterial community succession during long-term ecosys?tem development〔J〕.Molecular Ecology，2013，22（12）：3415-3424.

〔6〕GUO H C，WANG W B，LUO X H，et al.Characteristics of rhizosphere and bulk soil microbial communities in rubber plantations in Hainan Island，China〔J〕.Journal of Tropical Forest Science，2015，27（2）：202-212.

〔7〕王韻，王克林，鄒冬生，等.廣西喀斯特地區(qū)植被演替對土壤質(zhì)量的影響〔J〕.水土保持學(xué)報(bào)，2007，21（6）：130-134.

〔8〕范延輝，王君，王進(jìn)賓.黃河三角洲貝殼堤放線菌多樣性及抑菌活性〔J〕.土壤通報(bào)，2016，47（5）：1142-1147.

〔9〕郭正彥.Streptomyces alboflavus313發(fā)酵液中抑菌成分的研究〔D〕.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

〔10〕尹明遠(yuǎn)，張格杰，何建清，等.西藏羊八井高溫地?zé)崽镏卸仁葻岱啪€菌多樣性及生物活性〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（12）：1-4.

〔11〕張盼盼，秦盛，袁博，等.南方紅豆杉內(nèi)生及根際放線菌多樣性及其生物活性〔J〕.微生物學(xué)報(bào)，2016，56（2）：241-252.

〔12〕袁桂峰，黃大林，徐雅娟，等.二株具有抗菌活性紅樹林土壤放線菌的分離鑒定〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2756-2757.

〔13〕李玲玲，羅合春，張先淑.柴胡內(nèi)生真菌鑒定與抑菌活性篩選〔J〕.生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（10）：165-170.

〔14〕林鵬，張瑜斌，鄧愛英，等.九龍江口紅樹林土壤微生物的類群及抗菌活性〔J〕.海洋學(xué)報(bào)（中文版），2005（3）：133-141.

〔15〕崔翠.渭北黃土區(qū)農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)核桃根際土壤及根系分泌物化感作用研究〔D〕.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

〔16〕JANGID K，WHITMAN W B，CONDRON L M，et al.Soil bacterial community succession during long-term ecosys?tem development〔J〕.Molecular Ecology，2013，22（12）：3415-3424.

〔17〕MENGE D N，HEDIN L O，PACALA S W.Nitrogen and Phosphorus Limitation over Long-Term Ecosystem Devel?opment in Terrestrial Ecosystems〔J〕.PloS One，2012，7（8）：e42045.

〔18〕CHAIA E E，WALL L G，HUSSDANELL K.Life in soil by the actinorhizal root nodule endophyteFrankia.A re?view〔J〕.Symbiosis，2010，51（3）：201-226.

〔19〕PELTZER D A，WARDLE D A，ALLISON V J，et al.Un?derstanding ecosystem retrogression〔J〕.Ecological Mono?graphs，2010，80（4）：509-529.

〔20〕吳林坤，林向民，林文雄.根系分泌物介導(dǎo)下植物-土壤-微生物互作關(guān)系研究進(jìn)展與展望〔J〕.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，38（3）：298-310.

〔21〕BULGARELLI D，SCHLAEPPI K，SPAEPEN S，et al.Structure and Functions of the Bacterial Microbiota of Plants〔J〕.Annual Review of Plant Biology，2013，64（1）：807.

〔22〕EISENHAUER N，SCHEU S，JOUSSET A.Bacterial Di?versity Stabilizes Community Productivity〔J〕.PloS One，2012，7（3）：e34517.

〔23〕BENSON D R，SILVESTER W B.Biology ofFrankiastrains，actinomycete symbionts of actinorhizal plants〔J〕.Microbiological Reviews，1993，57（2）：293-319.

〔24〕杜慧娟，王伯初，米鵬程，等.核桃內(nèi)生菌的分離及抗菌活性的初步研究〔J〕.氨基酸和生物資源，2008（1）：61-64.

〔25〕郭小煒，馮俊濤，易曉華，等.大花金挖耳內(nèi)生菌的分離及抑菌活性篩選〔J〕.西北植物學(xué)報(bào)，2007（2）：377-383.

〔26〕趙珂.攀西地區(qū)核桃內(nèi)生及根際放線菌的多樣性與抗菌活性研究〔D〕.成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.