徐 帆

(重慶三峽中心醫(yī)院病理科 40400)

表皮生長因子受體基因(EGFR基因)是非小細胞肺癌((NSCLS)高頻驅(qū)動基因，先檢測、后治療的NSCLS靶向個體化治療模式已成為臨床診療規(guī)范。所有接受EGFR靶向酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TK1)治療的患者都需要接受EGFR分子檢測。病理科所開展的石蠟塊EGFR基因突變檢測法是利用活檢組織脫水后制成的石蠟塊進行的DNA提取，然后實時熒光定量PCR分析結(jié)果，極大地方便了患者，但需確保敏感性和特異性。質(zhì)量保證和質(zhì)量控制是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中重要的環(huán)節(jié)包括石蠟塊的DNA提取[1]，檢測中的設(shè)備、試劑及實驗室的檢測環(huán)境。目前所有試劑公司在DNA提取的操作規(guī)范說明書中均要求對石蠟塊切片脫蠟處理時使用二甲苯，但二甲苯具有極強的揮發(fā)性，對人體健康有影響。美國勞工部的職業(yè)安全與衛(wèi)生管理處規(guī)定二甲苯的安全空氣濃度在100 ppm以下，而目前分子實驗室的工作環(huán)境超出了此安全范圍。彌散在空氣中的二甲苯可以通過呼吸道吸入或皮膚黏膜接觸進入人體，損傷神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)，導(dǎo)致慢性中毒癥狀。對于空氣要求極其嚴格的分子實驗室環(huán)境污染大，我國已將二甲苯中毒定為職業(yè)病。有研究報道，松節(jié)油在病理蘇木素-伊紅(HE)制片的各個環(huán)節(jié)均能替代二甲苯，起到很好的效果[2-4]，而石蠟塊EGFR基因突變檢測中石蠟切片DNA提取過程中的脫蠟與HE制片中原理一致。本研究旨在尋找一種既能不影響實時熒光定量PCR結(jié)果分析，又能不污染實驗室工作環(huán)境的方法[5-6]，以確保各個環(huán)節(jié)的質(zhì)控，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 從2014年11月起，連續(xù)6個月收集本院病理科石蠟標本切片68份，均分成A組(二甲苯脫蠟)和B組(松節(jié)油脫蠟)進行石蠟塊EGFR基因突變檢測。DNA提取試劑盒由QIAGEN生物工程有限公司提供，EGFR突變檢測試劑盒由上海源奇生物公司提供，CObasZ480型PCR擴增儀器由羅氏公司提供。

1.2方法

1.2.1石蠟切片制作及脫蠟 標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，6 μm厚切片10～15片。將石蠟切片放入1.5 mL離心管中，A組加入1.0 mL二甲苯，B組加入1.0 mL松節(jié)油，蓋緊并劇烈震蕩混勻10 s，然后將標本置于56 ℃水浴中10 min脫蠟，室溫(15～25 ℃)下13 200×g離心5 min,吸取上清液丟棄。A組再加入1.0 mL二甲苯，B組再加入1.0 mL松節(jié)油，重復(fù)上述步驟2～3次，最后1次脫蠟離心10 min(大標本脫蠟2～3次，小標本脫蠟2次)。之后操作步驟嚴格按QIAGEN試劑盒及上海源奇試劑盒說明書進行。

1.2.2熒光定量PCR檢測 擴增條件：42 ℃ 5 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s；60 ℃ 80 s，共40個循環(huán)，反應(yīng)體系共25 μL。在PCR循環(huán)第2步60 ℃時收集熒光信號。檢測通道為：FAM，參比熒光設(shè)定為none。(1)基線的確定：軟件默認為3～15個循環(huán)的平均熒光信號為基線。在實驗中，一般選擇曲線波動較小，較穩(wěn)定的片段作為基線，可根據(jù)實際情況自行酌情調(diào)整。終點避免覆蓋信號已經(jīng)開始有明顯增長的地方，且以起點與終點間間隔8個循環(huán)以上為原則。(2)閾值的確定：在陰性對照無擴增的情況下，以閾值設(shè)定在無典型擴增曲線樣本的最高點，且陰性對照未檢出為原則，確定起始閾值。(3)不同的反應(yīng)液應(yīng)分別單獨確定各自的基線和閾值后，再進行各自分析。

1.2.3實驗初期為了確保每次實驗的客觀性及準確性，每份標本都送上海源奇生物公司總部實驗室進行印證實驗，結(jié)果均相符合。本實驗室也在2016年參加了病理質(zhì)控評價中心(PQCC)分子病理室間質(zhì)控石蠟塊EGFR的檢測，順利通過質(zhì)評并獲得PQCC室間質(zhì)評證書。

2 結(jié) 果

本研究實驗中檢測時均設(shè)立了外部質(zhì)控和內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)。外部質(zhì)控包含陽性及陰性對照，檢測結(jié)果外部質(zhì)控的陽性及陰性對照均符合要求；內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)均在有效范圍內(nèi)，顯示檢測過程規(guī)范、合理、有效。接收的同一標本檢測相同的靶點時A、B對照組選取規(guī)則的擴增曲線為有效的(疑似陽性標本)讀取其CT值，作為對照比較；不規(guī)則的擴增曲線為無效的作為陰性處理，不作為對照分析。68份標本中,每份標本A、B兩組內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)CT值均有效，差值均小于0.99，見表1、圖1。

表1 檢測結(jié)果有效性判定(n=68)

圖1 A、B組內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)擴增曲線比較

A：18號檢測靶點；B：19號檢測靶點；C：21號檢測靶點

圖2 A、B組各檢測靶點擴增曲線比較

在相同切片標本的18號檢測靶點中，A、B兩組均有3份疑似陽性標本，兩組擴增曲線CT值之差均小于0.99；結(jié)合內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)CT值分析，最終結(jié)果判定1份切片標本A、B兩組均為陽性，2份切片標本A、B兩組均為陰性。在相同切片標本的19號檢測靶點中，A、B兩組均有7份疑似陽性標本，兩組擴增曲線CT值之差均小于0.99；結(jié)合內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)CT值分析，最終結(jié)果判定3份切片標本A、B兩組均為陽性，4份切片標本A、B兩組均為陰性。在相同切片標本的21號檢測靶點中，A、B兩組均有11份疑似陽性標本，兩組擴增曲線CT值之差均小于0.99；結(jié)合內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)CT值分析，最終結(jié)果判定6份切片標本A、B兩組均為陽性，5份切片標本A、B兩組均為陰性。本研究中只檢測到18、19、21這3個靶點的陽性結(jié)果進行比對，其他的3個靶點未檢測到陽性結(jié)果。最終結(jié)果分析表明同一份切片標本分為A、B兩組經(jīng)不同的脫蠟劑處理后同時實時熒光定量PCR分析，結(jié)果無差異，陽性及陰性結(jié)果判定相符。A、B組各檢測靶點擴增曲線比較，見圖2。

3 討 論

EGFR基因共28個外顯子，其中編碼酪氨酸激酶的是第18～21號外顯子。關(guān)于EGFR基因突變的研究表明，盡管突變部位分散整個酪氨酸激酶編碼區(qū)，但絕大多數(shù)突變集中在第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點突變。本實驗使用的EGFR突變檢測試劑盒由上海源奇生物公司提供，檢測18、19、20、21、S768I、T790M，共6個靶點，方法簡便、快速、準確。進行EGFR基因突變檢測時，本研究將每份石蠟切片分入A、B兩組，分別用二甲苯和松節(jié)油脫蠟處理后[7]，同時進行實時熒光定量PCR擴增，探討兩組擴增曲線的差異性，保證EGFR基因突變檢測結(jié)果判讀的客觀性和準確性[8-9]，同時又為實驗室塑造一個良好的工作環(huán)境，確保實驗操作每一個過程有效合理[10]。分析A、B兩組同一份石蠟切片檢測相同靶點時有效擴增曲線CT值，以及內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)參)CT值之差均小于0.99，最終判定兩組陽性、陰性結(jié)果均相符，確定采用二甲苯和松節(jié)油兩種脫蠟劑后實時熒光定量PCR擴增實驗結(jié)果判讀一致，完全相符。本報道旨在研究石蠟塊EGFR基因突變檢測時使用不同的脫蠟劑后，實時熒光定量PCR擴增曲線形態(tài)的相似性，CT值結(jié)果比對的差異性，以及最終對實時熒光定量PCR擴增結(jié)果相符度的比較。至于在基因突變檢測諸多方法中，如熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和DNA測序，不同的脫蠟劑對結(jié)果有無影響則需要進一步的研究。

綜上所述，采用二甲苯和松節(jié)油對石蠟切片行脫蠟處理后，其實時熒光定量PCR分析結(jié)果判讀無差異。對于靶點的檢測無影響[11-12]。由于二甲苯具有極強的揮發(fā)性，對人體健康有一定的影響，而松節(jié)油對人體無害，采用松節(jié)油脫蠟既保證了分子實驗室的空氣環(huán)境，保護了工作人員的身體，同時又不影響實時熒光定量PCR結(jié)果分析的準確性及可靠性[13]，可使實驗室的操作更加規(guī)范、科學(xué)、合理。

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