程驍 ，鄧敏貞 ，侯紫君 ，華榮 ，孫景波

1.廣東省中醫(yī)院腦病中心，廣東 廣州 510120

2.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006

3.河南南陽(yáng)理工學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又稱(chēng)老年性癡呆，是一種發(fā)生于中老年的原發(fā)性腦退行性疾病，其患病率隨著社會(huì)的老齡化而增加，已成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。雖然AD的病理機(jī)制至今仍不清楚，但基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失、海馬區(qū)突觸大量喪失是AD的主要病理改變[1]。海馬是腦處理學(xué)習(xí)記憶功能的重要結(jié)構(gòu)，這一功能與海馬突觸可塑性關(guān)系密切。成熟的神經(jīng)系統(tǒng)雖然不再產(chǎn)生新的神經(jīng)元，并且神經(jīng)元胞體一直保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但神經(jīng)元卻具有產(chǎn)生新的突起和形成新的突觸連接的能力，同時(shí)神經(jīng)元的突起包括軸突末梢、樹(shù)突及樹(shù)突側(cè)棘等一直處于可修飾狀態(tài)，這種能力是神經(jīng)環(huán)路可塑性的基礎(chǔ)[2]。清腦通絡(luò)方對(duì)AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為有明顯的改善作用[3]，為了觀察該方的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)探討該方對(duì)AD模型大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性Wistar大鼠，3月齡15只，體質(zhì)量200～250 g，為青年組。20月齡60只，體質(zhì)量450～550 g，隨機(jī)抽取15只用作為老年組，其余45只大鼠為造模組。所有大鼠均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為26-2005A001，實(shí)驗(yàn)在廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0094。

1.2 儀器和試劑 D-半乳糖(上海試劑二廠)；鵝膏蕈氨酸(美國(guó)Sigma公司)；動(dòng)物腦立體定位儀(美國(guó)Stoling公司)；清腦通絡(luò)方(決明子、丹參、山楂、赤芍、川芎、水蛭等用水提醇工藝制成2 g/mL藥液，4℃保存)；石杉?jí)A甲(臨用前配制成6 mg/100mL液體)。

1.3 模型制備與干預(yù) 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，造模組45只大鼠腹腔注射0.96%D-半乳糖(生理鹽水配制)，5mL/(kg·d)，連續(xù)6周。青年組和老年組大鼠腹腔注射生理鹽水，5mL/(kg·d)，連續(xù)6周。從第7周開(kāi)始，造模組大鼠雙側(cè)基底前腦注射鵝膏蕈氨酸，以3%戊巴比妥鈉35mg/kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于腦立體定位儀上，縱向切開(kāi)頭皮，暴露顱骨，參照paxins和watson大鼠腦立體定位圖譜(Academic Press，1982)[4]，梅納特基底核(Meynert基底核)坐標(biāo)為AP-0.8 mm，Lat 2.6 mm，DV-8.2 mm(前囟后0.8 mm，中線旁開(kāi)2.6mm，顱骨下8.2mm)，每側(cè)緩慢注射鵝膏蕈氨酸1μL(生理鹽水配制，濃度 5μg/μL)，注射時(shí)間每側(cè) 10 min，留針10 min。青年組和老年組在相同腦區(qū)注射等體積的生理鹽水。2周后，將造模組存活的大鼠隨機(jī)分為模型組、清腦通絡(luò)方組和石杉?jí)A甲組，每組10只。清腦通絡(luò)方組以清腦通絡(luò)方灌胃，5mL/(kg·d)，相當(dāng)于生藥量6 g/(kg·d)；石杉?jí)A甲組以石杉?jí)A甲灌胃，5mL/(kg·d)，相當(dāng)于生藥量0.3mg/(kg·d)；模型組、青年組和老年組以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

1.4 標(biāo)本制備與觀察 取每組大鼠各3只，以含0.2%戊二醛、4%多聚甲醛的磷酸緩沖液經(jīng)心灌注固定，取腦，置同樣固定液后固定4 h。各標(biāo)本均取海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)同一部位組織，組織塊大小約1mm3，每一部位取組織塊4～6個(gè)。用0.01mol/LPBS洗組織塊3次，每次15min，1%鋨酸固定1 h后(4℃)，再用0.01mol/LPBS洗3次，每次15min。梯度酒精脫水，用50%，70%酒精各5min，80%，90%，95%，99%酒精各10min，再用100%酒精脫水2次，每次10min，用丙酮脫水2次，每次10min。用丙酮∶包埋劑＝1∶1，滲透1 h；丙酮∶包埋劑＝1∶3，滲透2 h，純包埋劑共滲透3 h。將滲透后的組織塊放在盛有苯二甲酸二丙烯酯包埋劑(包埋劑配方：苯二甲酸二丙烯酯10mL、鄰苯二甲酸二丁酯2mL、過(guò)氧化苯甲酰0.4～0.6 g)的膠囊內(nèi)，置60℃烤箱，聚合48 h。超薄切片：片厚600A，230目銅網(wǎng)撈片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染。

電鏡觀察與拍照：每只大鼠每一部位觀察3個(gè)銅網(wǎng)，每張銅網(wǎng)由左上角至右下角斜線上移動(dòng)，隨機(jī)拍攝照片5張，共15張。突觸放大倍數(shù)2萬(wàn)倍，拍照，最終放大倍數(shù)4萬(wàn)倍。

1.5 突觸形態(tài)參數(shù)的定量分析 用體視學(xué)方法分析海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度(Nv)、突觸連接帶面密度(Sv)和突觸連接帶平均面積(S)。在透明膠片上繪制2mm×2mm的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試網(wǎng)格，將該測(cè)試網(wǎng)格覆蓋于電鏡照片上，按Freddari[5]方格點(diǎn)計(jì)數(shù)法逐一測(cè)量每張照片中的突觸數(shù)量和突觸連接帶與測(cè)試線的交點(diǎn)數(shù)，用下列公式計(jì)算突觸的數(shù)密度、面密度和平均面積。

Na是每個(gè)平方微米的突觸總數(shù)，L是突觸連接帶的平均長(zhǎng)度(μ m)，可由公式 L＝ La/Na；La＝ (π /2)× (Ni／ LT)計(jì)算得到，T為超薄切片的厚度(600A)，LT為測(cè)試線總長(zhǎng)度，Ni為突觸連接帶與測(cè)試線的交叉點(diǎn)數(shù)，K0＝1＋3T/2L為校正系數(shù)，校正因子Holmes'效應(yīng)引起的對(duì)突觸連接帶長(zhǎng)度的過(guò)高估計(jì)。Sv＝ 2Ni／ LTK0(μm2/μm3)，突觸連接帶的平均面積 S＝ Sv/Nv。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)突觸特征 見(jiàn)圖1。電鏡下可見(jiàn)老年組和青年組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)氈膜性結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元的樹(shù)突可見(jiàn)到各種斷面，斷面較平滑、完整。模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)氈膜性結(jié)構(gòu)皺縮，神經(jīng)元的樹(shù)突可見(jiàn)斷面較少，突觸附近空泡化較多。清腦通絡(luò)方組和石杉?jí)A甲組神經(jīng)氈膜性結(jié)構(gòu)皺縮緩解，神經(jīng)元的樹(shù)突可見(jiàn)斷面增多，突觸附近空泡化減弱，突觸前、突觸后神經(jīng)細(xì)胞膜增厚，有些突觸后膜增厚更明顯，突觸前后膜之間有明顯的突觸間隙，在突觸前終末(presynaptic terminal)內(nèi)可見(jiàn)大量突觸小泡和線粒體。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)突觸特征 (×40 000)

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度（Nv）結(jié)果比較 見(jiàn)表1。老年組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度與青年組比較無(wú)明顯變化。與老年組比較，模型組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，清腦通絡(luò)方組和石杉?jí)A甲組大鼠在CA1區(qū)和CA3區(qū)的突觸數(shù)密度顯著增加(P＜0.05，P＜ 0.01)。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度（Nv）結(jié)果比較(±s) 個(gè)/μm3

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度（Nv）結(jié)果比較(±s) 個(gè)/μm3

與老年組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別青年組老年組模型組清腦通絡(luò)方組石杉?jí)A甲組n 15 15 10 10 10 CA1 2.743 6±0.489 1 2.708 2±0.567 5 2.091 7±0.456 9①2.447 7± 0.416 8③2.254 1± 0.427 8②CA3 2.712 5±0.512 1 2.677 9±0.436 2 2.181 3± 0.443 2①2.476 3±0.449 3③2.345 7±0.429 6②

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸面密度（Sv）結(jié)果比較 見(jiàn)表2。老年組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸面密度與青年組比較無(wú)明顯變化。與老年組比較，模型組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸面密度顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，清腦通絡(luò)方組大鼠在CA1區(qū)和CA3區(qū)的突觸面密度增加(P＜0.01)，石杉?jí)A甲組大鼠在CA3區(qū)突觸面密度增加(P＜0.01)。與石杉?jí)A甲組比較，清腦通絡(luò)方組大鼠在CA1區(qū)的突觸面密度增加(P＜ 0.01)。

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸平均面積（S） 比較見(jiàn)表3。各組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)的突觸平均面積均無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。

3 討論

AD主要由腎精虧虛，腦髓失充，痰瘀互阻，導(dǎo)致腦髓枯萎所致，治療應(yīng)化瘀祛痰開(kāi)竅，補(bǔ)腎填髓[6]。課題組成員在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出老年性癡呆存在顱腦水瘀這一病理機(jī)制，瘀血與水濕痰濁互阻于腦內(nèi)為其主要病機(jī)，在臨床中使用清腦通絡(luò)方治療具有顱腦水瘀病理機(jī)制的疑難腦病，該方以通竅、化瘀、利水為主，由決明子、丹參、山楂、赤芍、川芎、水蛭等藥物組成，在臨床上有較好的效果[7]。實(shí)驗(yàn)研究亦表明，該方對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有較好的改善作用[3]。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸面密度 (Sv)結(jié)果比較(x± s) μm2/μm3

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸平均面積（S）比較(x± s) μm2

AD患者海馬區(qū)突觸大量丟失，造成學(xué)習(xí)記憶功能障礙。海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)被認(rèn)為是突觸傳遞可塑性的證據(jù)，并已成為研究學(xué)習(xí)記憶過(guò)程的突觸模式。大量研究報(bào)告對(duì)突觸多種結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定，探討突觸傳遞效能變化與形態(tài)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了某些傳遞效能與形態(tài)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)改變。學(xué)習(xí)記憶障礙與腦內(nèi)神經(jīng)信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)——突觸的可塑性變化有關(guān)，如衰老時(shí)發(fā)生腦內(nèi)突觸密度減低、突觸平均面積代償性增大及LTP減弱[8]等突觸可塑性變化。研究顯示，補(bǔ)腎益氣及活血化瘀方藥對(duì)老年性AD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)突觸數(shù)密度、面密度及突觸平均面積的減少均有改善作用[9]。

結(jié)果表明，老年組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸形態(tài)與青年組比較無(wú)明顯變化，突觸數(shù)密度、突觸面密度及突觸平均面積與青年組比較均無(wú)明顯改變，說(shuō)明單純生理性衰老對(duì)突觸沒(méi)有明顯影響。而模型組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸數(shù)密度、突觸面密度較青年組和老年組顯著下降，說(shuō)明基底前腦膽堿能神經(jīng)元損害對(duì)海馬突觸產(chǎn)生了顯著影響，造模成功。清腦通絡(luò)方組大鼠突觸數(shù)密度和突觸面密度無(wú)論在CA1區(qū)或CA3區(qū)均明顯高于模型組，說(shuō)明清腦通絡(luò)方可減少大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸的損傷。石杉?jí)A甲組大鼠在CA1區(qū)和CA3區(qū)的突觸數(shù)密度增加，CA3區(qū)突觸面密度增加，說(shuō)明石杉?jí)A甲可減少大鼠海馬CA3區(qū)突觸的損傷。清腦通絡(luò)方組與石杉?jí)A甲組比較，在CA1區(qū)，清腦通絡(luò)方組突觸面密度明顯高于石杉?jí)A甲組，在CA3區(qū)兩者未顯示出明顯差異，說(shuō)明清腦通絡(luò)方對(duì)模型大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸損害有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)范圍比石杉?jí)A甲廣，保護(hù)作用跟石杉?jí)A甲相近。此外，清腦通絡(luò)方組突觸面密度在CA1區(qū)已經(jīng)恢復(fù)到老年組水平，在CA3區(qū)還未恢復(fù)到老年組水平；其突觸數(shù)密度較模型組有明顯增高，但仍未恢復(fù)到老年組水平，這說(shuō)明清腦通絡(luò)方的主要保護(hù)作用是增加海馬CA1區(qū)突觸面密度。

綜上所述，清腦通絡(luò)方對(duì)老年性AD大鼠海馬突觸有顯著的改善作用，主要體現(xiàn)于減緩模型大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)突觸損害和增加海馬CA1區(qū)突觸面密度這兩個(gè)方面。

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