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北京棒桿菌AS 1.299發(fā)酵生產(chǎn)蛋氨酸的營養(yǎng)條件優(yōu)化

2018-07-02 07:55劉俊琦于金龍宋鳳亮
現(xiàn)代食品 2018年9期
關(guān)鍵詞:生物素蛋氨酸菌體

◎ 劉俊琦,于金龍,宋鳳亮

(1.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130000;

2.長春大成實業(yè)集團有限公司,吉林 長春 130000)

L-蛋氨酸(L-methionine)是一種含硫的氨基酸,是人體8種必需氨基酸中僅有的含硫氨基酸,與L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸共同屬于天冬氨酸的成員。蛋氨酸是含有1個氨基和1個羧基的中性氨基酸,小類又歸屬于非極性R基氨基酸。1個甲硫基(-SCH3)連接在C位碳原子上,因而也得名甲硫氨酸[1-3]。目前,天冬氨酸家族氨基酸除了L-蛋氨酸外,L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸在數(shù)年之前,就已經(jīng)實現(xiàn)高產(chǎn)的發(fā)酵法生產(chǎn)。因此,學(xué)者對于研究蛋氨酸的高產(chǎn)發(fā)酵法非常熱衷。本文采用的出發(fā)菌株為北京棒桿菌AS 1.299。

微生物的生命活動都與周圍的生長環(huán)境息息相關(guān),改變環(huán)境中的任何一個條件都會影響微生物的生命活動和生理狀態(tài),因此,適宜的生長環(huán)境對于維持微生物生長或發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的平穩(wěn)或特需至關(guān)重要。本文對北京棒桿菌AS 1.299發(fā)酵產(chǎn)蛋氨酸的營養(yǎng)條件進行優(yōu)化研究,確立最優(yōu)的搖瓶產(chǎn)酸條件,以實現(xiàn)蛋氨酸的高產(chǎn)。

1 試驗材料與方法

1.1 菌種

北京棒桿菌AS 1.299,由實驗室篩選提供。

1.2 培養(yǎng)基[8]

完全培養(yǎng)基(C.M)配制方法:液體培養(yǎng)基含有0.3%牛肉膏、1%蛋白胨和0.5% NaCl,調(diào)節(jié)pH為7.0~7.2;固體培養(yǎng)基配制需在液體基礎(chǔ)上加1.5%營養(yǎng)瓊脂。

種子培養(yǎng)基(S.M)配制方法:0.5%酵母浸膏、2%蛋白胨和0.3%的尿素作為氮源,4%的葡萄糖作為碳源,鹽類含K2HPO4和MgSO4·7H2O,含量各為0.05%,KH2PO4含量為0.15%,調(diào)節(jié)pH為7.0~7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(F.M)配制方法:含有0.4% (NH4)2SO4和0.1%的尿素作為氮源,4%的葡萄糖作為碳源,鹽類含KH2PO4和MgSO4·7H2O,含量各為0.05%,此外金屬鹽類含有 MnSO4·H2O 和 FeSO4·7H2O,含量各為0.02%,添加濃度為5 μg/100 mL的生物素以及濃度為200 μg/100 mL的硫胺素,調(diào)節(jié)pH為7.0~7.2;固體培養(yǎng)基需在此基礎(chǔ)上加2%瓊脂。

1.3 儀器

GTR10-2型高速冷凍立式離心機(北京時代北利離心機有限公司),HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海印溪儀器儀表有限公司),HY-4型往復(fù)式調(diào)速多用振蕩器(上海印溪儀器儀表有限公司),SW-CJ-2D(G)型凈化工作臺(上海印溪儀器儀表有限公司),AUY22O型分析天平(日本島津),LDZX系列智能型高壓蒸汽滅菌鍋(上海茸研儀器公司),大龍Dragon TopPette移液器,UV1700型紫外可見分光光度計(日本島津)。

1.4 試驗方法

1.4.1 蛋氨酸標準曲線的繪制[6]

對層析紙進行劃線處理,通常選上端1 cm處和下端2 cm處各畫一條直線,把蛋氨酸標準液配成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L和4.5 g/L共9個濃度,然后以相同的間距在層析紙下端直線上進行點樣,把含有樣品的層析紙置于層析液中,按照層析、干燥、顯色、洗脫的過程進行處理。然后把洗脫處理的樣品置于比色皿中,選取蒸餾水為對照,檢測波長512 nm下的吸光度值(OD)并構(gòu)建坐標系,其中縱坐標為蛋氨酸含量,橫坐標為OD值,繪制蛋氨酸的標準曲線。

1.4.2 菌體濃度的測定[7]

把培養(yǎng)好的菌液稀釋相同的倍數(shù),在660 nm波長下測定不同培養(yǎng)基中菌液的光密度值,光密度值越大,代表菌體濃度越大。

1.4.3 碳源的確定[8]

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中,選一個無碳源的作為空白對照,分別需要三組平行。進行高壓蒸汽滅菌,冷卻后接種北京棒桿菌AS 1.299,接種量為8%,30 ℃搖床培養(yǎng)2 d(速度180 r/min),取離心后的發(fā)酵液中的上清液,測洗脫液的OD值,通過蛋氨酸標準曲線獲得相應(yīng)蛋氨酸的產(chǎn)量,確定最佳碳源[9];在此基礎(chǔ)上進行單因素試驗,配制碳源濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%和14%的發(fā)酵培養(yǎng)基,確定碳源的最適濃度。

1.4.4 氮源的確定

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中,其他操作同1.4.3,確定發(fā)酵產(chǎn)蛋氨酸的最佳氮源[10-11],在此基礎(chǔ)上進行單因素試驗,配制氮源濃度分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%的發(fā)酵培養(yǎng)基,確定氮源的最適濃度。

1.4.5 金屬離子的確定

按1.2方法配制MgSO4·7H2O濃度為0.03%、0.05%、0.07%、0.09%和0.11%發(fā)酵液,然后分裝在3個三角瓶中,并且都做3個平行。以尿素為氮源,在121 ℃的條件下滅菌20 min,其他同上。

1.4.6 生物素濃度的確定

分別配制生物素濃度為1、3、5、7、9 μg/100 mL和11 μg/100 mL的發(fā)酵液,并且分裝在三角瓶中,且金屬離子MgSO4·7H2O的濃度確定為0.07%,其他同上。

1.4.7 營養(yǎng)條件的正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為根據(jù),正交優(yōu)化設(shè)計各個單因素,見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋氨酸的標準曲線

蛋氨酸含量與OD值呈線性關(guān)系,如圖1所示。得到的回歸方程為Y=61.976X-0.169 1(Y表示蛋氨酸含量,X表示OD值),其相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 9;說明蛋氨酸含量與OD值線性回歸比較顯著。

圖1 標準曲線圖

2.2 不同碳源及碳源濃度對菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量的影響

從2圖中可以看出,以葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源對產(chǎn)生蛋氨酸和菌體生長最有利。而通過空白對照發(fā)現(xiàn),缺乏碳源,不利于菌體生長,并且基本不產(chǎn)生蛋氨酸。圖3結(jié)果表明,蛋氨酸的產(chǎn)量在很大程度上受到葡萄糖濃度的影響,菌體的濃度和蛋氨酸的產(chǎn)量都是隨著葡萄糖濃度的增大而增大。菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量在葡萄糖濃度為8%時達到最大值,隨著葡萄糖濃度的繼續(xù)增大,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量都有所下降。更深入的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度達到一定高度值時,發(fā)酵液中的滲透壓就會升高,菌體細胞在高滲透環(huán)境中會滲出大量水分、電解質(zhì),影響菌體的生長,進而影響蛋氨酸的產(chǎn)量。由此可以得出,碳源是微生物菌體生長的必備營養(yǎng)條件,而葡萄糖與其他碳源相比較,效果最好。但是適宜的葡萄糖濃度對于菌體的生長和蛋氨酸的產(chǎn)量也是至關(guān)重要的,濃度過高或者過低都無法保證菌體的正常生長,這與國內(nèi)外的大多數(shù)研究報道結(jié)果相符。

圖2 不同碳源對蛋氨酸產(chǎn)量和菌體濃度的影響圖

圖3 不同葡萄糖濃度對蛋氨酸產(chǎn)量和菌體濃度的影響圖

2.3 不同氮源及氮源濃度對菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量的影響

不同氮源對蛋氨酸產(chǎn)量的影響如圖4所示。圖中結(jié)果表明,5種氮源中,尿素對菌體的生長和蛋氨酸的合成非常有利。其中,不加其他溶液,只把單獨的尿素作為氮源時,菌體的濃度和蛋氨酸的含量都達到了最高值。不同尿素濃度對菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量的影響如圖5所示。當(dāng)尿素濃度從0.3%增大到0.5%時,菌體濃度和蛋氨酸的產(chǎn)量隨著尿素濃度的增大而增加。當(dāng)濃度達到0.5%時,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量達到最大值。但當(dāng)尿素濃度繼續(xù)增大到1.1%時,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量反而出現(xiàn)了下降的趨勢。通過深入研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)尿素的濃度達到一定值時就會抑制菌體的生長,進而導(dǎo)致蛋氨酸的產(chǎn)量下降。由此可以得出,氮源對微生物菌體生長至關(guān)重要,而且不同的氮源對菌體濃度與蛋氨酸產(chǎn)量的影響非常顯著,而尿素與其他氮源相比較,效果最好。但是適宜的尿素濃度對于菌體的生長和蛋氨酸的產(chǎn)量也是至關(guān)重要的,濃度過高或者過低都無法保證菌體的正常生長,這個結(jié)果也與國內(nèi)外的大多數(shù)研究報道結(jié)果相符。

圖4 不同氮源對蛋氨酸產(chǎn)量和菌體濃度的影響圖

圖5 不同尿素濃度對蛋氨酸產(chǎn)量和菌體濃度的影響圖

2.4 不同濃度金屬離子對菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量的影響

不同濃度MgSO4·7H2O對菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量的影響如圖6所示。Mg2+是調(diào)節(jié)微生物生命活動的重要無機鹽離子,它是酶活性基團等的重要構(gòu)成部分,對激活酶活性也起著重要作用,從而促進菌體生長。從圖中可知,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量隨著MgSO4·7H2O濃度的增大而增大,MgSO4·7H2O濃度為0.07%時,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量達到最大值,繼續(xù)增加MgSO4·7H2O濃度,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量都下降。此實驗結(jié)果表明,金屬離子是菌體生長和產(chǎn)蛋氨酸的必備條件,而且適宜的離子濃度才能獲得高產(chǎn)量的蛋氨酸,濃度過高或者過低都會影響相關(guān)酶的活性,進而影響菌體濃度以及蛋氨酸的產(chǎn)量。

圖6 不同金屬離子濃度對蛋氨酸產(chǎn)量和菌體濃度的影響圖

2.5 不同生物素濃度對菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量的影響

圖7表明,不同生物素濃度對蛋氨酸產(chǎn)量的影響很明顯。從圖中的整體趨勢可以看出,過高或者過低的生物素濃度都會影響菌體濃度和蛋氨酸的產(chǎn)量,當(dāng)生物素濃度低于5 μg/100 mL時,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量隨著生物素濃度增大而逐漸增多,當(dāng)濃度達到5 μg/100 mL時,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量增加最多。當(dāng)生物素濃度較高時,菌體濃度和蛋氨酸產(chǎn)量隨著其濃度的增加反而都有下降的趨勢。研究發(fā)現(xiàn),生物素是菌體生長的一種重要生長因子,也是棒桿菌屬菌體發(fā)酵產(chǎn)蛋氨酸所必需的成分。而且,為了獲得高產(chǎn)量的蛋氨酸,生物素的濃度也要在合理的范圍內(nèi),超出一定的范圍,都會抑制菌體的生長進而影響蛋氨酸的產(chǎn)量。大量的國內(nèi)外文獻研究表明,菌體的生長對生物素濃度的要求極高,要想獲得高產(chǎn)量的蛋氨酸,必須濃度適宜。

圖7 不同生物素濃度的作用圖

2.6 營養(yǎng)條件正交實驗結(jié)果分析

從表2中可以看出,碳源、氮源、金屬離子和生物素對蛋氨酸產(chǎn)量的影響大小為C>A>B>D,金屬離子的影響最大,其次是葡萄糖和尿素,影響最小的是生物素,最佳條件組合為A2B1C2D3,即葡萄糖8%、尿素0.6%、MgSO4·7H2O 0.07%、生物素 5 μg/100 mL,此條件下蛋氨酸產(chǎn)量為2.326 g/L。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

3 結(jié)論

本文采用北京棒桿菌AS 1.299為出發(fā)菌株發(fā)酵生產(chǎn)蛋氨酸,研究了葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖以及無碳源對菌體濃度和蛋氨酸含量的影響,結(jié)果表明葡萄糖為最適宜碳源。研究了0.5%尿素、0.5%(NH4)2SO4、0.5%(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4和尿素比例4∶1、(NH4)2HPO4和尿素比例4∶1、(NH4)2SO4和(NH4)2HPO4比例1∶1作為氮源對對菌體濃度和蛋氨酸含量的影響,結(jié)果表明只有尿素為最適宜氮源。單因素的實驗結(jié)果表明,葡萄糖的最佳濃度為8%、尿素的最佳濃度為0.5%、MgSO4·7H2O的最佳濃度為0.07%、生物素的最佳濃度為5 μg/100 mL,在單因素實驗基礎(chǔ)上進行正交實驗設(shè)計,對蛋氨酸含量的影響順序是MgSO4·7H2O>葡萄糖>尿素>生物素,最佳營養(yǎng)條件組合為葡萄糖8%、尿素 0.6%、MgSO4·7H2O 0.07%、生物素 5 μg/100 mL時蛋氨酸產(chǎn)量為2.326 g/L。

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