汪 嬌，蔣 鵬，周建偉△

(1西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 四川 瀘州 646000; 2成都市青羊區(qū)人民醫(yī)院全科， 四川 成都 610031)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di-sease，NAFLD)是指除了酒精和其它明確損傷因素以外的，由于脂肪過(guò)量沉積在肝臟時(shí)的臨床病理綜合征[1-3]。NAFLD通常由肝臟脂質(zhì)合成和脂質(zhì)氧化紊亂引起，其中游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)在肝細(xì)胞中的蓄積具有關(guān)鍵作用。近年研究表明，一些傳統(tǒng)中藥中的天然成分具有調(diào)節(jié)血脂和抗氧化等作用，其中川陳皮素(nobiletin)提取自中藥陳皮，對(duì)多種慢性疾病有良好的防治作用[4-5]，但其對(duì)NAFLD的治療作用報(bào)道較少。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的單鏈RNA分子，因?yàn)槿狈Φ鞍踪|(zhì)編碼功能，以往的研究中被認(rèn)為是“垃圾基因”，最近研究表明，lncRNA參與了機(jī)體多種生物過(guò)程[6-8]，其中，lncLSTR(liver-specific triglyceride regulator)參與了肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控[2]。本研究擬采用離體細(xì)胞模型來(lái)研究川陳皮素對(duì)游離脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid，PA)[9]誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用及l(fā)ncLSTR可能的調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

肝細(xì)胞AML12購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。PA和川陳皮素購(gòu)自Sigma；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物序列通過(guò)PrimerBank網(wǎng)站在線獲得，PubMed網(wǎng)站進(jìn)行BLAST驗(yàn)證后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80%左右時(shí)消化、傳代。

2.2PA脂性培養(yǎng)基配制 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，采用0.2 mmol/L的PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)沉積。PA脂性培養(yǎng)基的配制主要步驟為：將PA粉末加入濃度為0.01 mol/L的NaOH溶液中，置70 ℃水浴30 min至PA完全溶解，配制成20 mmol/L的PA溶液；配制30%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，置55 ℃水浴30 min；取配置好的PA溶液200 μL與330 μL的BSA溶液混勻，加入20 mL的1640 RPMI-培養(yǎng)基，即配成終濃度為0.2 mmol/L的PA脂性培養(yǎng)基。

2.3油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積 將細(xì)胞接種于6孔板，對(duì)照(control)組細(xì)胞不做任何干預(yù)；PA組細(xì)胞加入0.2 mmol/L的PA培養(yǎng)24 h；預(yù)保護(hù)(protection)組分別加入1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L和50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護(hù)細(xì)胞2 h后，再加入0.2 mmol/L的PA刺激細(xì)胞，共同培養(yǎng)24 h。24 h后吸棄各組細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，10%甲醛固定15 min，油紅O染色30 min，60%異丙醇分化，蘇木素復(fù)染胞核，顯微鏡(×400)觀察及采集圖像。

2.4qPCR檢測(cè)基因表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，對(duì)照組、PA組和預(yù)保護(hù)組(50 mg/L川陳皮素)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。各組細(xì)胞用TRIzol法提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)為cDNA。檢測(cè)RNA濃度、純度和完整性后逆轉(zhuǎn)錄成cRNA。通過(guò)qPCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因的表達(dá)，反應(yīng)體系為20 μL。qPCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s、返回95 ℃ 10 s，擴(kuò)增39個(gè)循環(huán)；65℃～95 ℃，每0.5 ℃ 5 s梯度遞增；終止反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表1。熒光定量PCR系統(tǒng)為Applied Biosystems?7300，數(shù)據(jù)采用StepOne Software v2.3分析。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量 3組細(xì)胞蛋白用裂解緩沖液提取。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒定量蛋白濃度。蛋白樣品用5% SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與多克隆兔抗鼠 I 抗(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育12 h，隨后與辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔II抗在室溫1 h。采用凝膠成像儀采集圖像。使用Quantity One對(duì)蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，內(nèi)參照選用β-actin。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。3組數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差分析并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較。率或構(gòu)成比比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況

油紅O染色結(jié)果示，0.2 mmol/L的PA處理肝細(xì)胞24 h后，細(xì)胞脂質(zhì)沉積明顯；采用1 mg/L、5 mg/L和15 mg/L的川陳皮素預(yù)保護(hù)后再用PA處理細(xì)胞，細(xì)胞脂質(zhì)沉積無(wú)明顯變化；采用50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護(hù)后用PA處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減弱，見(jiàn)圖1。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護(hù)細(xì)胞。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

Figure 1. The lipid deposition in hepatocytes detected by Oil red O staining (×400).

圖1各組肝細(xì)胞油紅O染色情況

2 肝脂質(zhì)代謝相關(guān)因子的mRNA表達(dá)

為了確定川陳皮素減弱PA誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，本研究檢測(cè)了肝臟脂質(zhì)合成和氧化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)。相對(duì)于對(duì)照組，PA組的Apoc2表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，50 mg/L的川陳皮素預(yù)保護(hù)對(duì)其下調(diào)有抑制作用(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The mRNA expression of lipogenesis-and lipid oxidation-related factors in hepatocytes among groups detected by qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

圖2各組細(xì)胞脂質(zhì)合成和脂質(zhì)氧化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)

3 lncLSTR和Apoc2蛋白的表達(dá)

相對(duì)于對(duì)照組，PA組lncLSTR表達(dá)明顯升高(P<0.01)，預(yù)保護(hù)組lncLSTR表達(dá)比PA組降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3A。相對(duì)于對(duì)照組，PA組Apoc2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，預(yù)保護(hù)組Apoc2蛋白表達(dá)比PA組升高(P<0.01),見(jiàn)圖3B。

Figure 3. The expression of lncLSTR (A) and Apoc2 protein (B) in the hepatocytes among groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

圖33組細(xì)胞lncLSTR和Apoc2蛋白的表達(dá)

4 Apoc2蛋白與lncLSTR表達(dá)相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估Apoc2蛋白與lncLSTR的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PA組Apoc2蛋白與lncLSTR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R2=0.717 9，P<0.01),見(jiàn)圖4A；預(yù)保護(hù)組Apoc2蛋白與lncLSTR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R2=0.525 3，P<0.05),見(jiàn)圖4B。

討 論

NAFLD是影響全球數(shù)百萬(wàn)人的全球性慢性非傳染性疾病，是慢性肝病的危險(xiǎn)因素之一，已成為發(fā)達(dá)國(guó)家慢性肝病的重要病因。目前廣泛接受“二次打擊”理論來(lái)闡述NAFLD發(fā)病和進(jìn)展的理論：“一次打擊”為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積引起的,太多游離脂肪酸經(jīng)β氧化產(chǎn)生能量的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生多種氧自由基，導(dǎo)致線粒體損傷。脂質(zhì)沉積引起的慢性炎癥反應(yīng)構(gòu)成了“二次打擊”[11-13]。然而肝細(xì)胞脂肪沉積發(fā)生的確切機(jī)制和治療靶點(diǎn)目前尚缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在NAFLD的治療優(yōu)勢(shì)近年來(lái)逐漸受到重視，臨床實(shí)踐也證實(shí)中醫(yī)藥對(duì)于NAFLD的治療具有較好的效果。陳皮始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“橘柚，味辛溫而命名‘橘皮’”。《藥性論》記載陳皮具有清痰涎、開胃理氣調(diào)中之功效[14-15]。川陳皮素是從陳皮中提取的一種多甲氧基黃酮類化合物，目前已證實(shí)具有抗腫瘤、抗氧化和強(qiáng)心升血壓等藥理學(xué)作用，而且對(duì)腸平滑肌有雙向調(diào)節(jié)的作用，并可能對(duì)代謝性疾病有一定的防治作用[4-5]，但目前川陳皮素對(duì)于NAFLD的治療尚未有報(bào)道。本研究通過(guò)油紅O染色發(fā)現(xiàn)，50 mg/L的川陳皮素預(yù)處理能顯著降低PA引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。肝臟是主要的脂質(zhì)代謝器官，因此本研究檢測(cè)了12個(gè)肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)因子和10個(gè)脂質(zhì)氧化相關(guān)因子，結(jié)果顯示PA組Apoc2表達(dá)明顯下調(diào)，川陳皮素對(duì)其下調(diào)具有明顯抑制作用。Apoc2蛋白屬于載脂蛋白家族[2],能激活脂蛋白脂酶，清除細(xì)胞內(nèi)甘油三酯。在本研究中PA誘導(dǎo)Apoc2下調(diào)并導(dǎo)致甘油三酯清除率降低，而川陳皮素預(yù)保護(hù)可以抑制這種Apoc2下調(diào)導(dǎo)致的甘油三酯清除率降低。

Figure 4. The correlation analysis of Apoc2 protein and lncLSTR expression in PA group (A) and protection group (B).

圖4Apoc2蛋白與lncLSTR表達(dá)量的相關(guān)性分析

lncRNA被定義為長(zhǎng)于200 nt的轉(zhuǎn)錄本，但是由于缺乏開放閱讀框而不具備任何編碼蛋白的功能。雖然lncRNA的生理功能在很大程度上是未知的，但是許多l(xiāng)ncRNA在腫瘤、細(xì)胞周期和代謝中扮演了重要角色[16-17]。lncRNA可通過(guò)影響上游基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、抑制RNA聚合酶Ⅱ或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾、與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈干擾mRNA的剪切等方式調(diào)控生理功能[16]。文獻(xiàn)報(bào)道lncLSTR可以調(diào)控Apoc2的表達(dá)[2]，本研究lncLSTR發(fā)現(xiàn)PA組的lncLSTR表達(dá)上調(diào)，川陳皮素能抑制其上調(diào)。采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PA組和預(yù)保護(hù)組中Apoc2蛋白與lncLSTR的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明lncLSTR的上調(diào)可能直接/間接調(diào)控了Apoc2的表達(dá)，而川陳皮素有可能調(diào)節(jié)lncLSTR的表達(dá)來(lái)抑制PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，具體機(jī)制將在以后的研究中驗(yàn)證。

綜上所述，本次研究通過(guò)棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積建立NAFLD細(xì)胞模型，觀察到川陳皮素減輕PA對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。本研究的結(jié)果提示川陳皮素對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用主要是通過(guò)抑制肝臟中l(wèi)ncLSTR的上調(diào)、進(jìn)而抑制肝臟Apoc2下調(diào)、增加肝臟甘油三酯清除率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究為探索川陳皮素在治療NAFLD中的應(yīng)用和從中醫(yī)藥的角度尋找NAFLD治療上新的靶點(diǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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