張目涵，周力為，賀 欣，路 瑤，趙美華，馬 娜，馮百歲

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 炎癥性腸病中心， 吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)中國炎癥性腸病聯(lián)盟河南省炎癥性腸病中心， 河南 鄭州 450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)包括克羅恩病(Crohn disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，是以反復(fù)發(fā)作與緩解為特征的慢性非特異性腸炎。近年來亞洲的發(fā)病率飆升，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與免疫、環(huán)境、感染和遺傳有關(guān)。免疫反應(yīng)中各種細(xì)胞因子發(fā)揮了主要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素27(interleukin-27，IL-27)在感染、腫瘤和自身免疫性疾病中可激活淋巴和非淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，屬于IL-6/IL-12家族中的一員，主要由單核吞噬細(xì)胞合成[1]。研究發(fā)現(xiàn)IL-27既可促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th1分化[2]，又可抑制Th2和Th17免疫反應(yīng)[3]。NLRP3炎性小體由NOD樣受體蛋白 3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、caspase-1和含CARD的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)構(gòu)成，同樣參與固有免疫調(diào)節(jié)，其中活化的caspase-1可促進(jìn)IL-1β和IL-18前體的加工剪切為其成熟形式，具有強(qiáng)大的促炎作用[4]。近年來研究表明，NLRP3炎性小體在感染及自身免疫性疾病中，對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[5]。因此，我們通過觀察不同劑量的IL-27對葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織，以及對NLRP3炎性小體的影響，從而探究IL-27在IBD發(fā)病中的作用及可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠48只，6～8周齡(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；DSS(36～50 kD;MP Biomedicals)；重組IL-27注射液(eBioscience)；抗NLRP3、caspase-1和IL-1β抗體(Santa Cruz)；第一鏈 cDNA 合成試劑盒和SYBR Green Ⅰ熒光定量 PCR 試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)；IL-1β和IL-18 ELISA 試劑盒(達(dá)科為)；總RNA提取劑Trigol(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；RIPA裂解液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與標(biāo)本處理 雄性C57BL/6小鼠48只隨機(jī)分為4組，每組12只。對照(control)組自由進(jìn)食水，不進(jìn)行干預(yù)；DSS組給予蒸餾水配制的3% DSS溶液自由飲用10 d；低劑量IL-27(500 ng IL-27)組除自由飲用3% DSS溶液以外，用500 ng IL-27溶于300 μL去離子水中每日給予小鼠腹腔注射；高劑量IL-27(1 μg IL-27)組除自由飲用3% DSS溶液以外，用1 μg IL-27 溶于300 μL去離子水中每日給予小鼠腹腔注射。觀察小鼠體重變化、糞便性狀及便血情況，根據(jù)McCarthy等[6]在文獻(xiàn)中制定的疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評分標(biāo)準(zhǔn)評估炎癥程度。第12天將小鼠用頸椎脫臼法處死，取眼眶動(dòng)靜脈血后離心，取血清保存在-20 ℃冰箱中為ELISA檢測做準(zhǔn)備。取結(jié)腸組織部分液氮迅速凍存后保存于-80 ℃冰箱作為qPCR及Western blot檢測的標(biāo)本；部分經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于病理觀察。

2.2結(jié)腸組織標(biāo)本的HE染色 石蠟包埋后連續(xù)5 μm連續(xù)切片，所有切片均經(jīng)過脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，伊紅液染色，常規(guī)脫水，封片，根據(jù)Dieleman等[7]在文獻(xiàn)中制定的標(biāo)準(zhǔn)對組織行組織損傷指數(shù)(histological index，HI)評分。

2.3免疫組化檢測腸上皮組織中NLRP3的表達(dá) 所有蠟塊經(jīng)脫蠟，水化后，枸櫞酸鹽緩沖溶液于壓力鍋中加熱5 min高壓修復(fù)抗原，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%山羊血清封閉10 min后加 I 抗，4 ℃過夜。后標(biāo)本于室溫下PBS緩沖液沖洗，加生物素標(biāo)記的 II 抗10 min后用PBS緩沖液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素10 min后用PBS緩沖液。DAB顯色10 min，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水后封片。顯微鏡觀察，結(jié)果以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。評分標(biāo)準(zhǔn)：按陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比評分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；按染色強(qiáng)度評分，沒有染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深呈棕色為3分。將兩項(xiàng)得分相乘，0 分為陰性(-)，1～4 分為弱陽性(+)，5～8 分為陽性(++)，9～12 分為強(qiáng)陽性(+++)。

2.4qPCR檢測腸道組織NLRP3和IL-1β的mRNA表達(dá) 首先提取腸道組織總RNA，在液氮中研磨組織，按照Trigol試劑說明書逐步加入氯仿、異丙醇和乙醇等提取后用50 μL ddH2O溶解RNA樣品，提取后的產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳檢測純度，用紫外光分光光度檢測濃度。然后合成第一鏈cDNA，根據(jù)mRNA濃度，按試劑盒說明書分別加2×RT、隨機(jī)引物、RNA模板和RNase-free ddH2O，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取反應(yīng)物用于PCR，NLRP3、IL-1β及內(nèi)參照β-actin的引物序列見表1，反應(yīng)體系包括2× RealPCR 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模板1 μL、50×ROX reference dye 1 μL和DNase-free ddH2O 6.4 μL，共20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min； 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)40次。采用2-ΔΔCt法對各個(gè)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

2.5Western blot檢測腸道組織caspase-1表達(dá) 稱取結(jié)腸組織40 mg剪碎，加RIPA裂解液(含PMSF)400 μL，于冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液，并用BCA法檢測蛋白濃度。將檢測好濃度的蛋白樣品溶解后加入配置好的SDS-PAGE凝膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，100 V 20 min, 150 V 1 h。5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h后加 I 抗，4 ℃過夜，洗滌5 min，共3次，加入 II 抗，室溫2 h，洗滌5 min，共5次。加入發(fā)光液后進(jìn)行灰度分析。

2.6血清IL-1β和IL-18的ELISA檢測 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，加樣，溫育，加酶，溫育，洗滌，顯色后終止反應(yīng)，測定IL-1β和IL-18。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述，用Levene檢驗(yàn)方法進(jìn)行方差齊性分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，對方差分析有意義者行SNK-q法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。描述變量之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

結(jié) 果

1 各組小鼠一般狀況、DAI評分、結(jié)腸組織的HE染色及HI評分

對照組小鼠表現(xiàn)活躍，大便成形，體重逐步上升；DSS模型組第4天，小鼠開始出現(xiàn)活躍度下降，軟便，體重呈下降趨勢，第5天出現(xiàn)肉眼血便，體重明顯下降IL-27 (1 μg)組第5天出現(xiàn)稀便，第7天出現(xiàn)肉眼血便，體重下降程度明顯小于DSS模型組。各組小鼠DAI評分結(jié)果見表2。

取小鼠結(jié)腸組織做HE染色及HI評分，鏡下表現(xiàn)示對照組小鼠結(jié)腸組織黏膜完好，腺體結(jié)構(gòu)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；DSS模型組可見大片糜爛、潰瘍，黏膜組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，正常腺體結(jié)構(gòu)消失，黏膜層炎性細(xì)胞浸潤；高劑量IL-27組黏膜上皮基本完整，腺體基本排列規(guī)則，可見上皮層小片狀壞死，黏膜層少量淋巴細(xì)胞浸潤；低劑量IL-27組與DSS模型組類似。4組的HE染色見圖1，HI 評分結(jié)果見表2。

Figure 1. HE staining of mouse colonic sections in four groups (×100).

圖1各組小鼠結(jié)腸組織HE染色

2 免疫組織化學(xué)檢測腸組織NLRP3的表達(dá)

對照組小鼠腸道黏膜可見少量NLRP3陽性細(xì)胞，染色強(qiáng)度較弱；模型組小鼠腸道黏膜層可見大量陽性細(xì)胞； 高劑量IL-27組NLRP3表達(dá)較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)；低劑量IL-27組較模型組稍下調(diào)。NLRP3免疫組化結(jié)果見圖2，各組NLRP3陽性染色的百分比見表2。

Figure 2. The expression of NLRP3 in mouse colonic tissues (×400).

圖2NLRP3在小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)

表2各組小鼠DAI評分、HI評分和結(jié)腸組織NLRP3蛋白表達(dá)的陽性率
Table 2. The DAI score, HI score and positive rate of NLRP3 protein expression in mouse colonic tissues in the four groups (Mean±SD.n=12)

GroupDAI scoreHI score NLRP3 positive (%)Control1.48±0.300.49±0.310.75±0.75DSS7.86±0.97?6.52±0.67?9.16±1.4?IL-27(500 ng)7.83±1.19?6.41±0.91?8.17±1.12?IL-27(1 μg)6.61±0.92?#4.68±0.64?#6.10±1.6?#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDSS group.

3 qPCR檢測結(jié)腸組織NLRP3和IL-1β mRNA的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，模型組中NLRP3和IL-β的mRNA表達(dá)水平高于對照組，高劑量 IL-27組低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量 IL-27 組與模型組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。各組NLRP3和IL-1β的mRNA在結(jié)腸的相對表達(dá)量見圖3。

4 Western blot檢測結(jié)腸組織caspase-1的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果示，模型組中cleaved caspase-1蛋白水平高于對照組， 高劑量IL-27組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量IL-27組與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 3. The mRNA expression of NLRP3 and IL-1β in colonic tissues. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDSS group.

圖3NLRP3和IL-1β結(jié)腸組織中mRNA的表達(dá)

Figure 4. The protein expression of caspase-1 detected by Wes-tern blot. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDSS group.

圖4Westernblot檢測caspase-1的蛋白表達(dá)

5 ELISA檢測血清中IL-1β和IL-18的含量

ELISA結(jié)果顯示，模型組血清中IL-1β和IL-18含量高于對照組，高劑量 IL-27 組低于模型組，低劑量IL-27 組同樣低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3小鼠血清IL-1β和IL-18含量的變化
Table 3. The IL-1β and IL-18 levels in the serum of mice (Mean±SD.n=12)

GroupIL-1βIL-18 Control102.00±6.5070.20±7.04 DSS118.00±2.70?86.50±7.79? IL-27 (500 ng)89.20±4.32#73.40±6.47?# IL-27 (1 μg)86.00±4.36#69.30±5.08?#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDSS group.

討 論

炎癥性腸病是一組以反復(fù)發(fā)作與緩解為特征的慢性非特異性腸炎。盡管其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但目前普遍認(rèn)為是由環(huán)境因素，遺傳易感性、免疫異常反應(yīng)和感染等多種因素共同引起的，其中自身異常免疫反應(yīng)是主要的致病因素[8]。

IL-27是近期發(fā)現(xiàn)的IL-6/IL-12家族的細(xì)胞因子，可參與多種自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病和炎癥性腸病等[9]，然而在炎癥性腸病中的作用尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)在炎癥發(fā)生早期IL-27可誘發(fā)初始CD4+T細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化，從而促進(jìn)干擾素γ(inter-feron-γ，IFN-γ)產(chǎn)生，還可增加NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化，產(chǎn)生IFN-γ、IL-18腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等炎性細(xì)胞因子，從而發(fā)揮促炎癥作用[10-11]。然而在炎癥持續(xù)發(fā)展過程中，IL-27可抑制Th17及Th2應(yīng)答，促進(jìn)Treg細(xì)胞中Th1細(xì)胞的分化，分泌Th1細(xì)胞的特異性抑炎因子IL-10[12-15]。因此IL-27既可促進(jìn)炎癥反應(yīng)又可抑制炎癥反應(yīng)，具有雙向調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)研究了IL-27對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的影響。實(shí)驗(yàn)中我們分別用低劑量IL-27(500 ng)及高劑量IL-27(1 μg)干預(yù)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠，可以看到低劑量IL-27組小鼠血便、體重下降等情況無明顯好轉(zhuǎn)，鏡下表現(xiàn)與模型組相比無明顯變化；而高劑量IL-27干預(yù)后臨床癥狀可減輕，一定程度上緩解了結(jié)腸炎的發(fā)展，鏡下表現(xiàn)黏膜上皮基本完整，腺體排列基本規(guī)則，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤。因此初步說明了IL-27對結(jié)腸炎有一定的緩解作用。

NLRP3炎性小體是目前研究較為深入的炎性小體，在免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用，其是由NLRP3、caspase-1和ASC構(gòu)成的多蛋白復(fù)合物[16]。前體caspase-1(procaspase-1)活化后可促進(jìn)巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的趨化因子及促炎因子的活化成熟和分泌[17]。ASC是炎性小體重要的銜接蛋白，利用其N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域和C端的CARD結(jié)構(gòu)域招募NLRP3和pro caspase-1，從而組裝成NLRP3炎性小體。目前對炎性小體激活的機(jī)制還不是十分明確，可能為各種內(nèi)外源性配體信號(hào)通過K+外流、合成大量的活性氧簇和細(xì)胞內(nèi)ROS累積等激活NLRP3炎性小體[7,18-19]。激活的NLRP3炎性小體可促進(jìn)IL-18及IL-1β的分泌。近期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)成熟的IL-1β可通過NLRP3炎性小體促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)[20]。又有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可通過促進(jìn)IL-17A分泌的固有淋巴細(xì)胞和CD4+Th17 細(xì)胞的聚集調(diào)節(jié)腸道慢性炎癥[21]。同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸黏膜組織中的IL-18可抑制杯狀細(xì)胞的成熟導(dǎo)致腸道功能障礙[22]。以上研究均說明了NLRP3炎性小體及剪切活化的IL-1β和IL-18在結(jié)腸炎中主要起促炎作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了在DSS模型小鼠中NLRP3和caspase-1表達(dá)量均增加，并且caspase-1剪切活化的IL-18及IL-1β同樣增加。

有研究證實(shí)在自身免疫性疾病中，IL-27還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)分子CD39的表達(dá)，而CD39表達(dá)量的增加可降低細(xì)胞外ATP的濃度，從而抑制核苷酸依賴激活的NLRP3炎性小體[23]。但在結(jié)腸炎中，IL-27與NLRP3炎性小體的相關(guān)研究較少。因此我們進(jìn)一步探究了IL-27是否可以通過影響NLRP3炎性小體的生成和激活從而影響結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。我們在建立DSS結(jié)腸炎模型的基礎(chǔ)上，通過免疫組織化學(xué)和qPCR在蛋白和基因水平檢測了小鼠結(jié)腸黏膜NLRP3的表達(dá)。與對照組相比DSS模型組其表達(dá)量增高，高劑量IL-27干預(yù)后其表達(dá)量下降；而低劑量IL-27干預(yù)后無明顯變化。同樣檢測IL-1β的mRNA在結(jié)腸炎小鼠中的表達(dá)增高，高劑量IL-27干預(yù)后可抑制其轉(zhuǎn)錄。因此該提示了IL-27可能是通過抑制NLRP3炎性小體的激活，從而抑制NLRP3及IL-1β的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示DSS模型組小鼠腸黏膜中活化形式的caspase-1增高，經(jīng)IL-27干預(yù)后caspase-1較模型組下降。進(jìn)而檢測小鼠血清中IL-1β和IL-18，模型組兩者升高，而高劑量IL-27組抑制了其表達(dá)。因此我們推測，高劑量的IL-27可能是通過抑制NLRP3基因表達(dá)及活化的caspase-1蛋白的表達(dá)，減少NLRP3炎性小體的激活，從而抑制成熟的IL-1β、IL-18生成，減輕結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)。但低劑量的IL-27對結(jié)腸炎的緩解作用不明顯，與DSS模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。因此說明了IL-27需達(dá)到一定劑量才會(huì)對結(jié)腸炎起緩解作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了當(dāng)IL-27達(dá)到一定濃度時(shí)對結(jié)腸炎有一定的緩解作用，并且可影響NLRP3炎性小體的激活從而減輕炎癥反應(yīng)，因此可為臨床治療提供新的思路和靶向。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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