董 年，余埡妮，吳登敏，王蓓蓓，應(yīng)趙建，裘丹萍，董 莉，陳成水

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 浙江 溫州 325000)

腫瘤微環(huán)境由間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)共同構(gòu)成，在腫瘤的免疫逃避、浸潤轉(zhuǎn)移和化療耐藥等惡性生物學(xué)行為方面發(fā)揮了重要作用,是肺癌5年生存率居高不下的原因之一[1]。目前肺癌的腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白和纖連蛋白異常沉積的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。既往研究認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞尤其是成纖維細(xì)胞的活化是ECM異常沉積的中心環(huán)節(jié)，目前逐漸認(rèn)識到肺癌細(xì)胞可以直接參與ECM的合成和分泌[2]。已知轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以經(jīng)調(diào)控PI3K等信號通路參與腫瘤細(xì)胞ECM的合成分泌，深入研究TGF-β1調(diào)控PI3K信號通路的分子機(jī)制可以從腫瘤微環(huán)境的角度挖掘腫瘤防治的潛在靶點(diǎn)。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是一組具有氧化活性的蛋白，包括NOX-1、NOX-2、NOX-3和NOX-4等，主要經(jīng)產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，并參與ECM合成和分泌等生物學(xué)功能[3]。研究報道NOX-4在肺癌組織中相較于癌旁組織過高表達(dá)，過高表達(dá)的NOX-4與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]，然而關(guān)于其在惡性肺癌細(xì)胞ECM異常分泌的機(jī)制尚未闡明。結(jié)合我們之前的研究發(fā)現(xiàn)脂酰肌醇3-激酶(phosphatylinositol 3-kinase，PI3K)家族PIK3CD亞基的異常表達(dá)和PI3K信號通路的過度激活與ECM異常沉積密切相關(guān)[5-6]，本研究擬在研究NOX-4是否參與TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞 I型膠原蛋白(collagen type I, collagen I)表達(dá)的基礎(chǔ)上，深入探討NOX-4是否調(diào)控PIK3CD的表達(dá)和PI3K信號通路的活化以尋找TGF-β1/PI3K軸潛在的中介蛋白，為肺癌ECM異常沉積揭示潛在靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人肺癌細(xì)胞株A549購于上海中科院細(xì)胞庫。

2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；人重組TGF-β1購自PeproTech；NOX-4抑制劑二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium, DPI)購自Sigma；BCA蛋白濃度測定試劑盒、預(yù)染蛋白Marker和ECL 發(fā)光液購自Thermo；兔抗人p-Akt和Akt單抗購自CST；兔抗人NOX-4和collagen I單抗購自Abcam；TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；其它生化試劑購自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司設(shè)計合成，見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

3 方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞株使用包含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2細(xì)胞干預(yù) 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于12孔板(抽提RNA)和6孔板(抽提蛋白)，待細(xì)胞長至孔板面積80%時，進(jìn)行分組干預(yù)，每個分組設(shè)立3個復(fù)孔，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 按照TRIzol說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃10 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參照，對目的基因進(jìn)行相對定量，用2-ΔΔCt法計算。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA測蛋白濃度。每組取30 μg蛋白行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， I抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min，II抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果以各蛋白與GAPDH灰度值比值表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞中NOX-4和collagen I的表達(dá)

選取5 μg/L的TGF-β1刺激A549細(xì)胞，于不同時點(diǎn)檢測NOX家族和collagen家族的mRNA表達(dá)；根據(jù)real-time PCR結(jié)果，選取不同濃度的TGF-β1刺激A549 細(xì)胞48 h，Western blot法檢測Nox-4和collagen I蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示TGF-β1可以誘導(dǎo)NOX家族中的NOX-4和collagen家族中的collagen I的表達(dá)，呈濃度和時間依賴性升高，其中5 μg/L TGF-β1是最適刺激濃度，TGF-β1刺激48 h后collagen I升高最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of NOX-4 and collagen I in A549 cells induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of NOX family and collagen family induced by TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time; B: the protein level of NOX-4 and collagenⅠchanged by the vehicle and TGF-β1 at different doses for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group;△P<0.05;△△P<0.01vs0 μg/L group.

圖1TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞中NOX-4和collagenI的表達(dá)

2 抑制NOX-4部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的collagen I表達(dá)升高

使用不同濃度的NOX-4抑制劑DPI預(yù)處理A549細(xì)胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激48 h，real-time PCR和Western blot結(jié)果可見NOX-4抑制劑DPI可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中collagen I的表達(dá)(P<0.05)，見圖2。

3 TGF-β1誘導(dǎo)PI3K 催化亞基PI3KCD表達(dá)和PI3K信號通路活化

選取5 μg/L濃度的TGF-β1刺激A549細(xì)胞不同時間，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以激活PI3K信號通路，呈現(xiàn)時間依賴性,見圖3A; real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)PIK3 class I亞基中PIK3CD的表達(dá)，呈現(xiàn)時間依賴性,見圖3B。

Figure 2. Inhibition of NOX-4 blocked TGF-β1-induced expression of collagen I. A: the mRNA expression of collagen I was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at different doses with TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h; B: the protein level of collagen I was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L with TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsTGF-β1 group.

圖2抑制NOX-4部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的collagenI表達(dá)升高

Figure 3. TGF-β1 induced PI3K/Akt signaling pathway activation and up-regulated the expression of PIK3CD. A: the protein levels of Akt and p-Akt challenged with TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time; B: the mRNA of PIK3 class I catalytic subunits induced by TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3TGF-β1誘導(dǎo)PI3K催化亞基PIK3CD表達(dá)和PI3K信號通路活化

4 抑制NOX-4降低TGF-β1誘導(dǎo)PI3K信號通路的活化程度

選取適宜濃度(5 μmol/L)的NOX-4抑制劑DPI預(yù)先處理A549細(xì)胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激不同時間，real-time PCR和Western blot檢測PIK3CD亞基和PI3K信號通路活化情況。結(jié)果所示,抑制NOX-4并不影響TGF-β1誘導(dǎo)的PIK3CD表達(dá)，但可以干擾TGF-β1活化PI3K信號通路，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

討 論

既往認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞尤其是成纖維細(xì)胞的活化是ECM異常沉積的中心環(huán)節(jié)[7]，NADPH氧化酶與ECM異常沉積的相關(guān)研究主要集中在成纖維細(xì)胞。Tobar等[8]報道JNK信號通路調(diào)控NOX-4來源的ROS參與乳腺癌基質(zhì)細(xì)胞的成纖維細(xì)胞樣分化和腫瘤纖維化生;類似的是，Hanley等[9]發(fā)現(xiàn)抑制NOX-4可以降低腫瘤間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞表型的間質(zhì)細(xì)胞比例。不同于之前研究聚焦于間質(zhì)細(xì)胞,我們選取了TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞表達(dá) collagen I的細(xì)胞模型來模擬肺癌細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)的病理生理過程，發(fā)現(xiàn)TGF-β1在誘導(dǎo)collagen I表達(dá)的同時伴隨NOX-4的過高表達(dá)，而抑制NOX-4部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的collagen I表達(dá)升高，說明NOX-4可能參與TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞 collagen I表達(dá)。與我們的研究類似，Hiraga等[10]報道NOX-4參與TGF-β1誘導(dǎo)胰腺腫瘤的上皮間質(zhì)變過程。

Figure 4. Inhibition of NOX-4 attenuated TGF-β1-induced PI3K signaling pathway activation. A: the mRNA of PIK3CD was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L and TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h; B: the protein levels of Akt and p-Akt challenged with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L and TGF-β1 (5 μg/L) for 30 min. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsTGF-β1 group.

圖4抑制NOX-4降低TGF-β1誘導(dǎo)PI3K信號通路的活化程度

TGF-β1是公認(rèn)的促纖維化因子，主要經(jīng)經(jīng)典的Smad信號通路和非經(jīng)典Smad信號通路介導(dǎo)ECM中collagen和纖連蛋白(fibronectin)等蛋白的合成分泌[11],其中非經(jīng)典Smad通路PI3K信號通路是研究熱點(diǎn)，已有研究報道抑制NOX-4后胰腺癌細(xì)胞經(jīng)調(diào)控PI3K信號通路促進(jìn)細(xì)胞自噬[12]。無論是PI3K class I催化亞基(包括PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG)的異常表達(dá)還是PI3K信號通路的過度激活皆與胞外基質(zhì)的合成分泌密切相關(guān)[5-6]，是否NOX-4可以經(jīng)影響PI3K相關(guān)途徑逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的collagen I表達(dá)？我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1在誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞collagen I表達(dá)的同時可以誘導(dǎo)PIK3CD的表達(dá)和PI3K信號通路的活化，而抑制NOX-4并不影響TGF-β1誘導(dǎo)的PIK3CD表達(dá)卻可以降低TGF-β1誘導(dǎo)PI3K信號通路的活化程度，說明NOX-4主要經(jīng)影響PI3K信號通路的活化參與collagen I的表達(dá)調(diào)控。與此同時Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NOX-4可以顯著促進(jìn)PI3K信號通路活化，而抑制PI3K信號通路可以降低NOX-4的表達(dá)。以上研究不僅從正反兩面論證了NOX-4是PI3K信號通路活化的中介蛋白，而且揭示NOX-4和PI3K信號通路之間的正向反饋?zhàn)饔霉餐龠M(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖、遷徙和ECM合成、分泌。

雖然我們研究初步揭示了NOX-4調(diào)控PI3K信號通路參與TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞表達(dá)collagen I的分子機(jī)制，然而研究尚存不足。首先，NOX-4屬于NADPH氧化酶家族，主要經(jīng)釋放ROS發(fā)揮病理生理作用[14]，本研究中并未闡明TGF-β1/NOX-4/ROS/PI3K軸之間的直接線性關(guān)系；其次，NOX-4可以激活Ras/ERK、JNK以及PI3K等眾多信號通路[15]，抑制NOX-4部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的collagen I表達(dá)升高并不是簡單的經(jīng)降低TGF-β1誘導(dǎo)PI3K信號通路的活化程度，以后的研究勢必聚焦多條信號通路之間的協(xié)同/拮抗作用；然后，我們研究中僅僅選取了一個代表性的肺癌細(xì)胞系，考慮到實(shí)驗(yàn)的可靠性，以后勢必要在多種肺癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證。

總而言之，我們研究發(fā)現(xiàn)NOX-4調(diào)控PI3K信號通路參與TGF-β1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞表達(dá)collagen I，初步闡述了TGF-β1/NOX-4/PI3K軸在調(diào)控肺癌細(xì)胞collagen I表達(dá)中的分子機(jī)制，NOX-4中介蛋白可能是未來針對肺癌ECM過度沉積的干預(yù)靶點(diǎn)之一，從腫瘤微環(huán)境的視角為肺癌的防治提供新的思路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5):646-674.

[2] Shintani Y, Maeda M, Chaika N, et al. Collagen I promotes epithelial-to-mesenchymal transition in lung cancer cells via transforming growth factor-β signaling[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008, 38(1):95-104.

[3] Skonieczna M, Hejmo T, Poterala-Hejmo A, et al. NADPH oxidases: insights into selected functions and mechanisms of action in cancer and stem cells[J]. Oxid Med Cell Longev, 2017, 2017:9420539.

[4] Wu Q, Yao B, Li N, et al. Nrf2 mediates redox adaptation in NOX4-overexpressed non-small cell lung cancer cells[J]. Exp Cell Res, 2017, 352(2):245-254.

[5] 應(yīng)趙建, 黃曉敏, 余埡妮, 等. PI3K/CTGF信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)collagenⅠ過程中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(3):489-494.

[6] Ge Q, Moir LM, Trian T, et al. The phosphoinositide 3’-kinase p110δ modulates contractile protein production and IL-6 release in human airway smooth muscle[J]. J Cell Physiol, 2012, 227(8):3044-3052.

[7] Yang F, Ning Z, Ma L, et al. Exosomal miRNAs and miRNA dysregulation in cancer-associated fibroblasts[J]. Mol Cancer, 2017, 16:148.

[8] Tobar N, Toyos M, Urra C, et al. c-Jun N terminal kinase modulates NOX-4 derived ROS production and myofibroblasts differentiation in human breast stromal cells[J]. BMC Cancer, 2014, 14:640.

[9] Hanley CJ, Mellone M, Ford K, et al. Targeting the myofibroblastic cancer-associated fibroblast phenotype through inhibition of NOX4[J]. J Natl Cancer Inst, 2018， 110(1):109-120.

[10] Hiraga R, Kato M, Miyagawa S, et al. Nox4-derived ROS signaling contributes to TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells[J]. Anticancer Res, 2013, 33(10):4431-4438.

[11] Jeon HS, Jen J. TGF-beta signaling and the role of inhibitory Smads in non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2010, 5(4):417-419.

[12] Mochizuki T, Furuta S, Mitsushita J, et al. Inhibition of NADPH oxidase 4 activates apoptosis via the AKT/apoptosis signal-regulating kinase 1 pathway in pancreatic cancer PANC-1 cells[J]. Oncogene, 2006, 25(26):3699-3707.

[13] Zhang C, Lan T, Hou J, et al. NOX4 promotes non-small cell lung cancer cell proliferation and metastasis through positive feedback regulation of PI3K/Akt signaling[J]. Oncotarget, 2014, 5(12):4392-4405.

[14] 劉洪彬, 于世勇. NADPH氧化酶4在AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成中的作用研究[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 40(11):2401-2403.

[15] Lassegue B, Griendling KK. NADPH oxidases: functions and pathologies in the vasculature[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(4):653-661.