蘇書娟，樊 濤，孫義長，任金山

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院放療科， 河南 南陽 473000)

肺癌是常見的惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病率及死亡率不斷攀升[1]。目前以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療在肺癌，特別是不宜手術(shù)的晚期肺癌的治療中仍起著無可替代的作用，而臨床治療過程中腫瘤細(xì)胞對各類化療藥物產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象大幅降低了藥物的療效，給肺癌的治療帶來了極大的阻力[1-3]。因此，探討肺癌化療耐藥的有效評估指標(biāo)，尋找潛在的治療靶點成為改善患者預(yù)后和提高臨床療效的重要工作。

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性多為獲得性耐藥，產(chǎn)生機(jī)制頗為復(fù)雜，且大多數(shù)涉及幾種機(jī)制的聯(lián)合作用[4]。研究顯示，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制主要包括[4-8]腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)等膜蛋白的高表達(dá)促進(jìn)化療藥物的外排/減少化療藥物的攝入，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、化療藥物作用靶點的質(zhì)與量出現(xiàn)改變、酶系統(tǒng)的異常表達(dá)致使腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)功能和細(xì)胞的解毒功能加強(qiáng)、激素受體的減少及抗凋亡基因的表達(dá)改變致使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡抑制等。

大量研究顯示，微小RNA(microRNA， miR)的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，包括獲得耐藥性的出現(xiàn)密不可分[9]。miR-24廣泛表達(dá)于人體的多種組織中，可發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育、增殖及凋亡等功能。有趣的是其在不同的細(xì)胞中對增殖及凋亡的調(diào)控作用不盡相同[10-13]，如在肝癌[11]及舌鱗癌[12]中miR-24可靶向不同的基因促進(jìn)癌細(xì)胞的生長，而Li等[13]的研究則表示miR-24-3p可靶向Prdx-6抑制胃癌細(xì)胞N87的生長、侵襲及遷移，促進(jìn)其凋亡。因此，探討miR-24對某個特定腫瘤細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制對于相關(guān)腫瘤的個性化治療具有重大的臨床意義。早期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-24在肺癌患者腫瘤組織及血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示miR-24在肺癌中可能發(fā)揮癌基因樣作用[14]，但其與肺癌耐藥之間的關(guān)系尚不清楚，故而本文通過轉(zhuǎn)染miR-24抑制物序列(miR-24 inhibitor，miR-24-i)下調(diào)A549/DDP細(xì)胞中的miR-24表達(dá)，探究miR-24在肺腺癌細(xì)胞A549化療獲得性耐藥中的作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

肺腺癌細(xì)胞株A549及肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP購買于中科院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、Opti-MEM培養(yǎng)基及RPMI-1640培養(yǎng)基均購自Gibco；miR-24 inhibitor(5’-CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA-3’)、陰性對照microRNA(miR-negative control，Neg； 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)、SYBR Green I real-time PCR Kit及野生型和突變型p53基因3’UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-3’UTR和Mutant-3’UTR)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；P53 小分子干擾RNA(P53 siRNA)及其陰性對照RNA(control siRNA)均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗P53、Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-9、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，p-ERK)、ERK及 β-actin 單克隆抗體購自Santa Cruz；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；順鉑(cisplatin，CDDP)購于齊魯制藥公司；紫杉醇(paclitaxel，PTX)購于海南海藥股份有限公司；ERK特異性抑制劑U0126購于Cell Signaling；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，其中A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)液中間斷性加入1 mg/L的順鉑以維持其耐藥性。培養(yǎng)箱設(shè)置為5% CO2、37 ℃、飽和濕度。首先取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR-24 inhibitor(10 μmol/L)或等體積miR-negative control溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，標(biāo)記為A液；另取Lipofectamine 2000溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，標(biāo)記為B液；將A液和B液輕柔混合，室溫反應(yīng)25 min；而后將混合物加入相應(yīng)組別的細(xì)胞中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。檢測轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實驗分析。

2.2Real-time PCR檢測miR-24及P53 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，參照Trizol一步法操作手冊抽提細(xì)胞總RNA并定量。取2 μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA(反應(yīng)終體積為20 μL)，采用SYBR Green real-time PCR試劑盒檢測miR-24及P53 mRNA的表達(dá)。miR-24的正向引物的序列為5’-TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3’，反向引物的序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； U6作為內(nèi)參照，正向引物的序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物的序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 P53的正向引物的序列為5’-GACCCAGGTCCAGATGAAGCT-3’，反向引物的序列為5’-ACCGTAGCTGCCCTGGTAGGT-3’；β-actin作為內(nèi)參照，正向引物的序列為5’-ATCTACGAGGGGTATGCC-3’；反向引物的序列為5’-TAGCTCTTCTCCAGGGAG-3’。反應(yīng)采用ABI7300 real-time PCR檢測系統(tǒng)，先94 ℃孵育5 min變性,然后進(jìn)行35個PCR循環(huán)(94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s)。采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)量。

2.3細(xì)胞化療藥物體外敏感性的檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中(接種密度為每孔1×104)，待細(xì)胞貼壁融合至80%～90%時同步化12 h，加入不同濃度的順鉑或紫杉醇(濃度梯度設(shè)置為0、0.01、0.1、1、10和100 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)46 h，加入100 μL 的CCK-8試劑繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值，計算相應(yīng)藥物的IC50并比較轉(zhuǎn)染miR-24 inhibitor后A549/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性的變化。每組設(shè)置3個復(fù)孔，取均值。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測 本實驗采用Annexin V /PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞分組處理48 h,離心收集各組細(xì)胞后用PBS漂洗3次，加入Binding Buffer 重懸細(xì)胞。先后向細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC(室溫避光孵育10 min)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液(室溫避光染色5 min)，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，檢測條件設(shè)置為：Ex=488 nm；Em=530 nm。

2.5Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞分組處理48 h,采用RIPA裂解收集各組細(xì)胞蛋白并定量，調(diào)整各組蛋白上樣量至80 μg，加入Loading Buffer(蛋白體積：loading buffer體積=1∶4)，98 ℃水浴變性。準(zhǔn)備好的蛋白樣品上樣后行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜(200 mA恒流)。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，依據(jù)說明書要求加入相應(yīng)比例的I 抗，4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后TBST洗滌3次，每次5 min；加入相應(yīng)的 II 抗，置于搖床上室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。于暗室中將HRP-ECL發(fā)光液灑在PVDF膜的蛋白面上激發(fā)熒光，壓X片、顯影、定影并沖洗膠片。實驗結(jié)果采用ImageJ灰度分析軟件進(jìn)行蛋白半定量分析。

2.6螢光素酶報告基因檢測 從生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫TargetScan挑選p53作為候選靶點。依據(jù)miR-24和P53 3’UTR可能的結(jié)合位點，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建野生型(WT-3’UTR)及突變型(MUT-3’UTR)p53基因螢光素酶報告基因質(zhì)粒，并將上述質(zhì)粒和/或miR-24 inhibitor轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，通過檢測螢光素酶的活性來驗證p53是否是miRNA-24的作用靶點。轉(zhuǎn)染方法同2.1。實驗分組為：空載體(psi-CHEK2)組、野生型p53基因(WT-3’UTR)組和突變型p53基因(MUT-3’UTR)組。依據(jù)說明書使用螢光素酶報告基因檢測儀檢測螢光素酶的活性。實驗結(jié)果以螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性的比值來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

將本實驗研究涉及數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計軟件包行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-24的表達(dá)與A549細(xì)胞化療耐藥的關(guān)系

本實驗首先檢測了肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其對照親本細(xì)胞株A549對2種化療藥物的IC50，結(jié)果證明A549/DDP細(xì)胞的化療耐藥性顯著強(qiáng)于A549細(xì)胞(P<0.05)，見表1。同時，real-time PCR的結(jié)果顯示，A549/DDP細(xì)胞中miR-24的表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞(P<0.05)，提示miR-24的表達(dá)可能與肺腺癌細(xì)胞A549化療耐藥之間存在相關(guān)關(guān)系，見圖1A。

表1肺腺癌細(xì)胞A549對化療藥物的敏感性
Table 1. Drug sensitivity (IC50) of human lung adenocarcinoma A549 cells (μmol/L. Mean±SD.n=6)

CellsCDDPPTXA5491.58±0.390.19±0.05A549/DDP 14.17±1.94?0.63±0.12?

*P<0.05vsA549 group.

Figure 1. The expression of miR-24. A: the expression of miR-24 in the A549 cells and A549/DDP cells; B: the expression of miR-24 in the A549/DDP cells after transfected with miR-24 inhibitor. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsA549 group;*P<0.05vscontrol group.

圖1miR-24的表達(dá)情況

2 下調(diào)miR-24對A549/DDP細(xì)胞化療敏感性的影響

A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-24 inhibitor后，細(xì)胞中miR-24的表達(dá)較對照組明顯降低(P<0.05)，見圖1B。化療藥物敏感性檢測結(jié)果顯示，下調(diào)A549/DDP細(xì)胞中miR-24的表達(dá)后，細(xì)胞對順鉑的敏感性明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2下調(diào)miR-24可提高耐藥細(xì)胞A549/DDP對化療藥物的敏感性
Table 2. Down-regulation of miR-24 increased drug sensitivity (IC50) of A549/DDP cells (μmol/L. Mean±SD.n=6).

GroupCDDPPTXControl14.17±1.940.63±0.12Neg13.86±1.540.57±0.13miR-24-i8.69±1.12?0.42±0.10?

*P<0.05vscontrol group.

3 下調(diào)miR-24對A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

相較于Neg組細(xì)胞，miR-24 inhibitor組細(xì)胞的早期凋亡率顯著增加(P<0.05)；而中晚期細(xì)胞凋亡/壞死率變化無顯著差異，表明下調(diào)miR-24可明顯促進(jìn)耐藥細(xì)胞A549/DDP的凋亡，見圖2。

4 下調(diào)miR-24對A549/DDP細(xì)胞線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot實驗的檢測結(jié)果顯示，與Neg組相比，miR-24 inhibitor組的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著下降，而凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平明顯增加，Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05)。此外，下調(diào)miR-24后可明顯促進(jìn)Cyt C釋放至胞漿，提示線粒體凋亡信號通路被激活，見圖3。

Figure 2. The effect of miR-24 down-regulation on the apoptosis of A549/DDP cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNeg group.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)miR-24對A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3. The effects of miR-24 down-regulation on the protein levels of mitochondrial apoptosis pathway related molecules in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3下調(diào)miR-24對A549/DDP細(xì)胞線粒體凋亡信號通路相關(guān)分子蛋白水平的影響

5 下調(diào)miR-24對ERK/P53信號通路的影響

本實驗進(jìn)一步檢測了細(xì)胞中調(diào)控凋亡的重要信號通路ERK信號通路的磷酸化情況，結(jié)果顯示，與Neg組相比，miR-24 inhibitor組中p-ERK的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，但是ERK總蛋白的水平并未出現(xiàn)顯著變化；同時P53的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，提示下調(diào)miR-24可活化ERK信號通路并提高腫瘤抑制因子P53的表達(dá)，見圖4A。

此外，本實驗還采用了ERK特異性抑制劑U0126來驗證miR-24 inhibitor所致ERK信號通路的激活是否與A549/DDP細(xì)胞凋亡有關(guān)，結(jié)果顯示預(yù)先給予25 μmol/L U0126處理1 h可部分恢復(fù)miR-24 inhibitor組的細(xì)胞活性，見圖4B。

Figure 4. The effects of miR-24 down-regulation on the protein levels of p-ERK and P53 and cell viability in A549/DDP cells. A: the protein levels of p-ERK and P53 after transfected with miR-24 inhibitor in the A549/DDP cells; B: the effect of U0126 incubation on cell viability. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNeg group;△P<0.05vsmiR-24-i group.

圖4下調(diào)miR-24對A549/DDP細(xì)胞ERK/P53信號通路相關(guān)分子蛋白水平和細(xì)胞活力的影響

6 miR-24靶基因的預(yù)測及驗證

通過生物信息學(xué)的方法，挑選P53作為miR-24的候選靶點，miR-24與P53的結(jié)合位點如圖5A所示。然后檢測miR-24對P53表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，miR-24 inhibitor可明顯促進(jìn)P53 mRNA的表達(dá)，見圖5B。雙螢光素酶報告基因檢測miR-24與P53的結(jié)合情況，結(jié)果顯示在WT-3’UTR組轉(zhuǎn)入miR-24 inhibitor，螢光素酶的活性較對照組降低(P<0.05)；而MUT-3’UTR組轉(zhuǎn)入miR-24 inhibitor，螢光素酶的活性沒有顯著改變，這一結(jié)果表明，miR-24可直接作用于p53基因的3’UTR區(qū)域來抑制其表達(dá)，見圖5C。功能恢復(fù)實驗顯示，共轉(zhuǎn)染miR-24 inhibitor和P53 siRNA之后，P53的表達(dá)顯著下降，同時A549/DDP的細(xì)胞活力部分升高(P<0.05)，見圖5D、E。

討 論

miR-24具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用，并通過不同的靶基因產(chǎn)生不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP中miR-24的表達(dá)水平顯著高于其親本細(xì)胞株，而轉(zhuǎn)染miR-24 inhibitor下調(diào)A549/DDP細(xì)胞中miR-24的表達(dá)可提高A549/DDP細(xì)胞對化療藥物的敏感性，由此推測，miR-24可參與影響肺腺癌A549細(xì)胞化療耐藥性的出現(xiàn)。

本實驗進(jìn)一步探討了miR-24調(diào)控肺腺癌A549/DDP細(xì)胞化療敏感性的作用機(jī)制。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，下調(diào)miR-24可明顯促進(jìn)耐藥細(xì)胞A549/DDP的凋亡，提示下調(diào)miR-24提高肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP對化療藥物的敏感性可能與促進(jìn)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。線粒體途徑是細(xì)胞的凋亡的重要途徑之一，當(dāng)某些內(nèi)外源因素致使線粒體外膜通透性增加時，Cyt C從線粒體內(nèi)膜釋放進(jìn)入胞質(zhì)中，并與procaspase-9等結(jié)合形成凋亡小體，繼而順序激活caspase-9及caspase-3等最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-17]。本實驗的檢測結(jié)果顯示，下調(diào)miR-24可促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞中線粒體Cyt C的釋放，激活caspase-9及caspase-3。Bcl-2家族是影響線粒體凋亡途徑的重要調(diào)控因子[18]，本實驗中，下調(diào)miR-24可促進(jìn)A549/DDP中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，表明下調(diào)miR-24可通過激活線粒體凋亡途徑促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞的凋亡。ERK信號通路是體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程的關(guān)鍵信號通路[19-20]。在較弱的刺激下，ERK信號通路的活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及生長；但是ERK蛋白的持續(xù)激活，不僅可參與P53信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡及自噬，還可加重化療藥物如順鉑等的細(xì)胞損傷作用[21-22]。研究顯示，在Ras/Raf/ERK信號通路持續(xù)激活時，腫瘤抑制因子P53的磷酸化水平升高，進(jìn)而影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)，最終通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡[23]。本實驗的檢測結(jié)果表明下調(diào)miR-24可活化ERK信號通路并提高腫瘤抑制因子P53的表達(dá)；且采用ERK特異性抑制劑U0126預(yù)孵A549/DDP細(xì)胞可部分恢復(fù)miR-24 inhibitor組的細(xì)胞活力，但是其中涉及的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究。此外，生物信息學(xué)分析顯示p53可能是miR-24的靶基因，兩者的直接結(jié)合進(jìn)而負(fù)調(diào)控P53的表達(dá)可能也是miR-24 inhibitor誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增加化療敏感性的一種分子機(jī)制。

Figure 5.p53 was a potential target gene of miR-24. A： miR-24 seed sequence and its complementary binding site inp53 3’UTR； B： the effect of miR-24 inhibitor on P53 mRNA expression in A549/DDP cells； C： relative luciference intensity in transfected A549/DDP cells； D： the transfection efficiency of P53 siRNA； E： impact of P53 siRNA and miR-24 inhibitor co-transfection on A549/DDP cell viability. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vspsi-CHECK2;△P<0.05vsmiR24-i group.

圖5p53可能是miR-24的靶基因

綜上所述，肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP中下調(diào)miR-24可靶向P53同時激活ERK/P53信號通路，繼而啟動線粒體途徑凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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