張德志 張宇 朱少功 梅家轉 季節(jié)

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率排名第三位的惡性腫瘤［1］，目前在中國每年新發(fā)病例約為37.5萬例，每年死亡病例為19.1萬例［2］。近年來貝伐珠單抗開啟了晚期CRC靶向治療的先河［3-4］。瑞戈非尼的獲批上市也為晚期CRC患者帶來新的治療選擇［5］。另外，在輔助化療領域，基于對“IDEA研究”的認可，2018年第1版美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南指出對于低危的Ⅲ期結腸癌患者推薦3個月的Xelox輔助化療方案［6］。目前，CRC術后輔助化療仍是以卡培他濱為基礎的化療方案為主［7］。但是，該方案在臨床應用過程中的療效有較大的個體化差異，部分患者會耐藥。因此，亟需進一步研究其敏感人群。

人體內的胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）在卡培他濱的代謝中發(fā)揮關鍵作用［8］。此過程將卡培他濱轉化為具有細胞毒作用的5-FU。另有研究表明，TYMP酶在腫瘤細胞內和血小板衍生內皮細胞生長因子結構非常相似［9］，具有促進腫瘤血管新生和轉移的重要作用［10］。多數研究也發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤中，TYMP均為高表達［11-13］。

TYMP基因位于染色體22q13.33，包含10個外顯子。TYMP基因在中國人群并不保守［8］。Huang等［14］研究探討在晚期胃腸道腫瘤中TYMP基因多態(tài)性位點rs11479的臨床意義。結果表明，在晚期胃腸道腫瘤中，攜帶T等位基因的患者，TYMP基因的表達水平較高。然而，目前在CRC輔助化療領域，尚缺乏TYMP基因5633C＞T位點和預后的關聯(lián)研究；另外，該基因的多態(tài)性位點和其mRNA表達的研究也較少。

因此，本研究旨在評估TYMP基因5633C＞T位點與接受卡培他濱為基礎輔助化療的CRC患者總生存期（overall survival，OS）的相關性，并探討該位點和CRC組織中TYMP基因mRNA表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2010年1月至2016年12月在鄭州人民醫(yī)院行R0切除術后接受輔助化療的CRC患者235例。入組標準：1）年齡≥18歲，ECOG評分在0～2分，心功能正常（左心室射血分數＞50%），腎功能正常（肌酐≤1.5×ULN），骨髓功能正常（中性粒細胞計數≥1.5×109/L，血小板計數≥100×109/L，血紅蛋白≥9 g/dL）；2）預期壽命≥3個月。排除標準：家族性腺瘤性息肉病，其他遺傳性CRC綜合征，失訪的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準（批號：ZZRMYY-100025-3），所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 化療方案 輔助化療的用法用量為：術后3～4周，卡培他濱，1 000 mg/m2，2次/天，第1～14天，每21天為1個周期；奧沙利鉑，80～130 mg/m2，靜脈滴注，第1天。輔助化療結合患者情況進行6～8個周期。根據治療過程中出現(xiàn)的血液學或非血液學毒性調整相應的給藥劑量，如果發(fā)生可能威脅生命的不良反應則中止治療。

1.2.2 血液樣本收集及基因分型 治療過程中收集患者的外周血樣本4 mL，采用苯酚氯仿法提取基因組DNA，之后置于-20°C保存。通過飛行時間質譜（美國Sequenom公司）的方法，按照說明書的標準操作步驟對每個樣本進行基因分型。分析設置陰性參照，10%的樣本至少分析1次來確保樣本未被污染，部分樣本的分型結果通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）法進行驗證。

設計包含5633C＞T位點（rs11479）的上下游PCR引物，上游引物為：5'-TCTAACAGCCCCTCGCTCT-3'，下游引物為：5'-GGGTCACGTGTTCATCGAG-3'。產物片段為266 bp，內切酶為BclI，通過片段長度判斷該位點的基因型。CC型：1條266 bp條帶；TT型：1條171 bp條帶，1條95 bp條帶；CT型：1條266 bp條帶，1條171 bp條帶，1條95 bp條帶。

1.2.3 組織樣本收集及TYMP表達分析 手術過程中收集每例患者被切除的CRC組織標本，最終87例組織標本納入研究，液氮保存。之后使用Trizol試劑進行RNA提取，應用上海羅氏real-time PCR儀器檢測TYMP mRNA表達，TYMP基因的上游引物為：5'-AT GGCAGCCTTGATGACC-3'，下游引物為：5'-TTATT GCTGCGGCGGCAG-3'。實時定量PCR反應體系如下：SYBN Premix Ex Tag溶液 10 μL，TYMP F primer（20 μM）0.2 μL，TYMP R primer（20 μM）0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA 2 μL；反應體系總計20 μL，GAPDH mRNA表達作為內參。TYMP mRNA采用相對定量法 2-ΔΔCt進行計算［15］。1.3 統(tǒng)計學分析

本研究中所有的變量均采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。χ2檢驗分析多態(tài)性位點基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料中，離散型的變量和5633C＞T（rs11479）位點不同基因型的分布采用χ2檢驗，當數據較少時采用Fisher精確檢驗。連續(xù)型的變量和5633C＞T位點不同基因型的分析采用非參檢驗的Mann-Whitney U（兩組間）或者Kruskal-Wallis H（多組間）檢驗。采用Stata 14.0軟件繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者OS的差異，曲線間的差異采用對數秩檢驗進行比較。OS的計算為手術的時間至患者死亡或最后一次隨訪結束。多變量分析時，對OS構建采用Cox風險比例模型，用向后LR的選擇步驟來篩選和校正潛在的混雜變量。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 235例CRC患者基線臨床資料及5633C＞T位點基因分型情況

入組的235例患者的基線臨床資料如表1所示，入組患者中位年齡為53歲，大部分患者為男性（63.83%）。結腸和直腸分別為143例和92例，大部分患者腫瘤分化中等（68.09%）。在臨床分期方面，Ⅱ期患者63例，Ⅲ期160例，Ⅳ期12例。輔助化療方面，所有患者均接受術后輔助化療，其中卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑方案158例（67.23%），卡培他濱單藥方案77例（32.77%）。

5633C＞T位點的基因分型結果為：野生型CC型149例（63.40%），CT型73例（31.06%），TT型13例（5.54%），最小等位基因頻率為0.21，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.313）。考慮到突變純合子TT型患者相對較少，后期分析中將CT和TT型患者合并。該位點不同基因型在基線臨床資料中的分布基本均衡（表1）。

將CT和TT型患者合并后共86例。在針對OS的單變量分析中，野生型CC型和突變型CT/TT型的兩組患者在OS上均具有顯著性差異，攜帶突變基因的CT/TT型患者和野生型CC型患者的中位OS分別為

2.2 TYMP基因5633C＞T位點對預后的影響

5.9年和4.5年（圖1）。野生型CC型患者相對于CT和TT型患者OS較差（P=0.009）。另外，本研究構建Cox風險比例模型，將可能影響OS的風險因素，如年齡、性別、腫瘤分化情況、病理分期以及5633C＞T位點納入該模型。經過多變量校正發(fā)現(xiàn)，5633C＞T位點對OS獨立的影響意義依然存在，并且具有顯著性差異（HR=0.67，P=0.015，表2），其他在Cox模型中具有顯著性差異的變量為年齡（HR=2.21，P=0.005）和病理分期（HR=2.87，P＜0.001）。

圖1 TYMP基因5633C＞T位點不同基因型患者的OS曲線對比

表2 影響OS的基線臨床資料和多態(tài)性位點的多變量Cox風險比例模型

2.3 5633C＞T位點對TYMP基因mRNA表達的影響

此外，本研究還納入87例術后切除的癌組織標本，通過提取的RNA對TYMP的表達情況進行分析，并和5633C＞T位點的基因型進行相關性統(tǒng)計。在87例癌組織標本中，CC型55例，CT型27例，TT型5例，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.495）。TT型患者相對較少，將TT和CT型患者合并共32例。野生型CC型相對于突變型CT和TT型患者，TYMP mRNA表達水平明顯較低，且具有顯著性差異（P=0.019，圖2）。

圖2 TYMP基因5633C＞T位點不同基因型表達情況對比

3 討論

本研究納入235例行手術治療的CRC患者，通過對TYMP基因5633C＞T位點基因分型和患者的預后進行關聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)該位點野生型CC型患者相對于攜帶T等位基因的CT和TT型患者OS較差，并通過87例組織標本的TYMP基因mRNA表達水平分析發(fā)現(xiàn)，該位點不同的基因型患者的mRNA表達水平呈較大的差異。5633C＞T位點可能通過影響TYMP基因的表達，進而使CRC患者從卡培他濱為基礎的輔助化療當中獲益。

CRC是異質性較強的惡性腫瘤［16］。目前，國內外有大量預測CRC療效的生物標記物研究報道相繼出現(xiàn)：2015年報道的CYP3A5多態(tài)性對FOLFIRI治療結果的影響［17］；2016年報道的胸苷酸合成酶TS多態(tài)性對結腸癌一線5-FU放療療效的影響［18］；2017年報道的四氫葉酸轉移酶MTHFR多態(tài)性對5-FU療效的影響［19］。

本研究結果表明，在中國CRC患者接受卡培他濱為基礎的輔助化療時，TYMP基因5633C＞T位點的T等位基因攜帶者可通過影響該基因的表達，從而使得該基因型患者對卡培他濱更為敏感，進而從卡培他濱的輔助化療中獲益。本研究結果和Huang等［14］研究結果基本一致，該研究納入晚期胃腸道腫瘤患者，結果表明5633C＞T位點的T等位基因攜帶者和較高的TYMP基因表達水平有關，這和本研究中CT/TT型患者的TYMP mRNA表達水平較高一致。然而，可能因為樣本量較少，該研究并未發(fā)現(xiàn)該位點和OS有顯著相關性。另外，Jennings等［20］研究發(fā)現(xiàn)，5633C＞T位點的T等位基因攜帶者與接受卡培他濱治療的CRC患者較多的不良反應有關。上述研究結果均表明，5633C＞T位點的T等位基因攜帶者對卡培他濱可能更為敏感。另一方面，在TYMP基因表達水平和CRC預后的關系上，目前各項研究尚存在較大的爭議。本研究表明TYMP mRNA高表達的人群更能從卡培他濱的治療中獲益，從而具有較好的預后，和Lu等［21］的研究結果一致。該研究納入57例1線接受卡培他濱聯(lián)合紫杉醇治療的晚期胃癌患者，分析TYMP mRNA的表達水平和治療的反應率以及與OS的關系，發(fā)現(xiàn)高表達的人群反應率較高，OS較好。然而，有其他研究結果發(fā)現(xiàn)，TYMP基因是促進腫瘤血管新生的重要因子，因此該基因高表達時通常伴隨較高的腫瘤負荷，從而腫瘤更易復發(fā)和轉移，進而預后更差［22］。但是上述研究中并未觀察卡培他濱的治療情況。因此，本研究推測TYMP基因在體內具有雙重作用，一方面通過刺激腫瘤細胞血管新生促進腫瘤生長；另一方面，該基因是卡培他濱的重要代謝基因，是5-FU類化療藥物發(fā)揮細胞毒作用的關鍵基因，從而具有殺滅腫瘤細胞的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在中國CRC患者中TYMP基因5633C＞T位點是獨立的OS影響因素。但本研究存在部分局限性，首先納入研究的樣本量較小，未在大樣本中評估該位點的預后指導意義；其次，本研究為回顧性分析，存在一定偏倚。本研究對5633C＞T位點的預后影響進行評估，同時從TYMP基因mRNA表達層面揭示該位點造成預后差異的部分原因，以期對CRC患者的預后指導提供參考。

[1]Bos A,Matthijsen RA,van Erning FN,et al.Treatment and outcome of synchronous colorectal carcinomas:a nationwide study[J].Ann Surg Oncol,2017,25(2):414-421.

[2]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[3]Rosen LS,Jacobs IA,Burkes RL.Bevacizumab in colorectal cancer:current role in treatment and the potential of biosimilars[J].Target Oncol,2017,12(5):599-610.

[4]馮穩(wěn),吳新新,郭永軍,等.結直腸癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與PD-L1表達的關系及臨床意義[J].中國腫瘤臨床,2017,44(12):589-593.

[5]Li J,Qin S,Xu R,et al.Regorafenib plus best supportive care versus placebo plus best supportive care in Asian patients with previously treated metastatic colorectal cancer(CONCUR):a randomised,doubleblind,placebo-controlled,phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2015,16(6):619-629.

[6]Lonardi S,Sobrero A,Rosati G,et al.PhaseⅢtrial comparing 3-6 months of adjuvant FOLFOX4/XELOX in stageⅡ-Ⅲ colon cancer:safety and compliance in the TOSCA trial[J].Ann Oncol,2017,28(12):3110.

[7]McQuade RM,Stojanovska V,Bornstein JC,et al.Colorectal cancer chemotherapy:the evolution of treatment and new approaches[J].Curr Med Chem,2017,24(15):1537-1557.

[8]Lam SW,Guchelaar HJ,Boven E.The role of pharmacogenetics in capecitabine efficacy and toxicity[J].Cancer Treat Rev,2016,(50):9-22.

[9]高慶,劉劍,張繼民.結直腸癌組織胸苷磷酸化酶表達臨床意義研究的現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(01):76-80.

[10]Elamin YY,Rafee S,Osman N,et al.Thymidine phosphorylase in cancer;enemy or friend[J]?Cancer Microenviron,2016,9(1):33-43.

[11]Zhang Q,Zhang Y,Hu X,et al.Thymidine phosphorylase promotes metastasis and serves as a marker of poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Lab Invest,2017,97(8):903-912.

[12]Furukawa T,Tabata S,Yamamoto M,et al.Thymidine phosphorylase in cancer aggressiveness and chemoresistance[J].Pharmacol Res,2018,(132):15-20.

[13]Toi M,Masuda N,Lee SJ.Capecitabine for primary breast cancer[J].Oncotarget,2017,8(67):110739-110740.

[14]Huang L,Chen F,Chen Y,et al.Thymidine phosphorylase gene variant,platelet counts and survival in gastrointestinal cancer patients treated by fluoropyrimidines[J].Sci Rep,2014,(4):5697.

[15]Freitag D,Koch A,Lawson McLean A,et al.Validation of reference genes for expression studies in human meningiomas under different experimental settings[J].Mol Neurobiol,2017.[Epub a head of print].

[16]Shaikh T,Handorf EA,Meyer JE,et al.Mismatch repair deficiency testing in patients with colorectal cancer and nonadherence to testing guidelines in young adults[J].JAMA Oncol,2018,4(2):e173580.

[17]Dong N,Meng F,Wu Y,et al.Genetic polymorphisms in cytochrome P450 and clinical outcomes of FOLFIRI chemotherapy in patients with metastatic colorectal cancer[J].Tumour Biol,2015,36(10):7691-7698.

[18]Patricia Rios-Ibarra C,Janeth Rodriguez-Silva C,Alonso Lopez-Chuken Y,et al.Thymidylate synthase polymorphism in Mexican patients with colon cancer treated with 5-fluorouracil[J].J BUON,2016,21(4):935-940.

[19]Yeh CC,Lai CY,Chang SN,et al.Polymorphisms of MTHFR C677T and A1298C associated with survival in patients with colorectal cancer treated with 5-fluorouracil-based chemotherapy[J].Int J Clin Oncol,2017,22(3):484-493.

[20]Jennings BA,Loke YK,Skinner J,et al.Evaluating predictive pharmacogenetic signatures of adverse events in colorectal cancer patients treated with fluoropyrimidines[J].PLoS One,2013,8(10):e78053.

[21]Lu M,Gao J,Wang XC,et al.Expressions of thymidylate synthase,thymidine phosphorylase,classⅢbeta-tubulin,and excision repair cross-complementing group 1 predict response in advanced gastric cancer patients receiving capecitabine plus paclitaxel or cisplatin[J].Chin J Cancer Res,2011,23(4):288-294.

[22]Huang X,Wang L,Chen Y,et al.Poor prognosis associated with high levels of thymidine phosphorylase and thrombocytosis in patients with renal cell carcinoma[J].Urol Int,2017,98(2):162-168.