李芳芳 馬磊 張振 朱穎慧 關(guān)新元③ 王鵬 秦艷茹

食管癌作為人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤死亡率中位居第四位［1］。目前基因診斷與基因治療在惡性腫瘤中的作用越來越突出。ALC1（amplified in liver cancer 1）為肝癌的最新候選癌基因，是從人體肝癌細(xì)胞的染色體1q21區(qū)分離并克隆的一個(gè)新基因，又名CHD1L（chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene）［2-4］。目前該基因與食管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮見報(bào)道。此次研究采用免疫組織化學(xué)法檢測ALC1在食管鱗癌組織及其癌旁組織中蛋白水平的表達(dá)，從而探討其與食管癌臨床病理特征的關(guān)系，并從細(xì)胞水平探討ALC1對食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

收集林州市人民醫(yī)院在2002年2月至2008年12月間手術(shù)獲取的289例食管癌組織及距癌組織超過5cm正常黏膜組織。用以上組織構(gòu)建食管癌組織芯片，其中44例組織標(biāo)本在免疫組織化學(xué)染色后不同程度缺失，予以剔除，剩余245例標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌，其中男性109例，女性136例；年齡在40～82歲，所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。本研究獲得患者知情同意，符合倫理學(xué)要求。

主要試劑：CHD1L（ALC1）兔抗人多克隆抗體及小牛血清蛋白（美國Sigma公司），非免疫山羊血清（福建邁新生物技術(shù)公司），蘇木素（hematoxylin，Mayer's）、二步法抗兔/鼠通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（丹麥DAKO公司），氯仿、二甲苯、無水乙醇、30%過氧化氫（廣州化學(xué)試劑廠），TRIzol Reagent（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑（美國Invitrogen公司）；DMEM（Gibco公司），脂質(zhì)體Lipfectamine 2000（Invitrogen公司）等。

食管癌細(xì)胞株：EC18&HKESC1為來自中國患者的兩種食管癌細(xì)胞株，KYSE30、KYSE140、KYSE180、KYSE410、KYSE510為來自日本患者的五種食管癌細(xì)胞株，由中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部保存。細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1（+）、感受態(tài)大腸桿菌Ecoli DH5α由中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色（SP法） 采用生產(chǎn)第二抗體的正常動(dòng)物血清封閉非特異性免疫球蛋白反應(yīng)，與省略第一抗體陰性切片作為空白對照，采用已知的陽性切片作陽性對照。主要步驟如下：石蠟切片脫蠟、梯度酒精至去離子水；3%H2O2室溫孵育15 min，純水洗滌1次；在0.5M EDTA緩沖液中煮沸20 min進(jìn)行熱抗原修復(fù)；芯片滴加非免疫山羊血清，室溫孵育20 min；加一抗，PBS+4%BSA混合液按1：900配制一抗工作液，每張芯片滴加150 μL一抗工作液，置濕盒內(nèi)，4℃冰箱孵育過夜12 h；室溫孵育20 min；二抗37℃孵育30 min；每張組織芯片滴加DAB工作液150 μL，光鏡下觀察顯色，終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染60 s；自來水沖洗1 min阻斷復(fù)染；1%鹽酸酒精浸泡1 s分化；二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：ALC1蛋白在食管癌組織中陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，在正常黏膜組織中ALC1的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核和胞漿。根據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞數(shù)的乘積評分［5］：a染色程度：0分為細(xì)胞核藍(lán)色，1分為細(xì)胞核淡黃色，2分為細(xì)胞核棕黃色，3分為細(xì)胞核棕褐色；b陽性細(xì)胞數(shù)：0分為陽性細(xì)胞數(shù)＜25%，1分為陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%，2分為陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)＞75%，a×b為4～9分者評為免疫組織化學(xué)染色陽性。顯微鏡×200鏡下計(jì)數(shù)至少5個(gè)隨機(jī)視野，取平均值。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 對篩選出的KYSE30食管癌細(xì)胞株培養(yǎng)（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)），轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞計(jì)數(shù)，最適宜細(xì)胞數(shù)量為80%～90%細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿，然后按Lipofectamine 2000試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用pcDNA3.1（+）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞通過G418藥物篩選，并挑選單克隆建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，PCR驗(yàn)證，并送公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染序列。

1.2.3 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ALC1mRNA的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染后食管癌細(xì)胞及空載體細(xì)胞的cRNA行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 PCR引物序列

ALC1 PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s 72℃ 1 min共30 Cycles 72℃延伸5 min；GAPDH PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；95℃ 30 s，58℃ 30 s 72℃ 1 min共26 Cycles 72℃延伸5 min；4℃冰箱保存PCR產(chǎn)物。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析ALC1基因及GAPDH內(nèi)參產(chǎn)物。

1.2.4 MTT比色試驗(yàn) 取對數(shù)生長期KYSE30-目的基因細(xì)胞及KYSE30-Vector細(xì)胞。以1×104個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每孔100 μL。條件培養(yǎng)48 h后，于不同時(shí)間點(diǎn)每孔加入MTT溶液，孵育4 h后離心棄上清，另加入二甲基亞砜（DMSO）振蕩數(shù)分鐘，選擇吸光度490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度A值，并記錄結(jié)果。細(xì)胞生長抑制率=（實(shí)驗(yàn)組平均A490-對照組平均A490）/對照組平均A490×100%，重復(fù)3次

1.2.5 平板克隆形成試驗(yàn) 分別取對數(shù)生長期的KYSE30-目的基因細(xì)胞及KYSE30-Vector細(xì)胞。胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液分別進(jìn)行適當(dāng)稀釋后加入6孔板中（1 000個(gè)細(xì)胞/孔），每孔2 mL，每組設(shè)3個(gè)平行孔。使細(xì)胞分散均勻，置37℃、5%CO2條件下，連續(xù)培養(yǎng)2～3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加75%乙醇溶液5 mL，固定30 min。2%結(jié)晶紫染液染30 min。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力 將Matrigel膠按50 μL/孔鋪在Transwell小室底部微孔聚碳酸膜上，恒溫孵育2 h成膠。調(diào)整KYSE30-目的基因細(xì)胞及KYSE30-Vector細(xì)胞的細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，小室上室分別加入200 μL各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液并套入下室，下室加入500 μL含15%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室，并用70%甲醇固定30 min，消毒棉簽擦去上室內(nèi)面的Matrigel和未穿越的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，在高倍鏡視野下計(jì)數(shù)小室下面細(xì)胞數(shù)即為穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力 制備KYSE30-目的基因細(xì)胞及KYSE30-Vector細(xì)胞的細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中均勻種植相同數(shù)量細(xì)胞，用槍頭均勻劃痕細(xì)胞后給予PBS清洗脫離下來的細(xì)胞，然后將培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24、48 h顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕的愈合情況。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類資料用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier分析ALC1表達(dá)與食管癌患者的生存關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALC1蛋白在ESCC及癌旁組織中表達(dá)

食管鱗癌組織中ALC1蛋白表達(dá)陽性率為41.6%（102/245），食管正常黏膜組織中ALC1蛋白表達(dá)陽性率為21.2%（52/245），兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2，圖1）。

表2 ALC1蛋白在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 例

圖1 食管鱗癌組織中ALC1蛋白陽性表達(dá)

2.2 ALC1蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

ALC1在ESCC中的表達(dá)增高與性別、年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度無關(guān)（P＞0.05）。ALC1與腫瘤的浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05，表3）。

表3 ALC1蛋白的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 ALC1表達(dá)對食管鱗癌患者預(yù)后的影響

ALC1蛋白表達(dá)升高的食管鱗癌患者的總生存率明顯低于ALC1蛋白低表達(dá)的食管鱗癌患者（P＜0.05，圖2）。

圖2 ALC1表達(dá)與食管鱗癌患者總生存的關(guān)系

2.4 RT-PCR檢測ALC1在食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

半定量RT-PCR結(jié)果顯示KYSE30、KYSE410、KYSE510三株食管癌細(xì)胞株ALC1表達(dá)較低，EC18、KYSE180、HKESC1、KYSE140四株食管癌細(xì)胞株ALC1呈現(xiàn)顯著高表達(dá)（圖3），因而選擇表達(dá)相對較低的KYSE30轉(zhuǎn)染ALC1。

2.5 MTT檢測轉(zhuǎn)染了ALC1的KYSE30細(xì)胞生長情況

MTT檢測ALC1在24、48及72h測定細(xì)胞增殖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KYSE30細(xì)胞轉(zhuǎn)染ALC1后的細(xì)胞生長較對照組均明顯升高，細(xì)胞體外增殖能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖3 RT-PCR檢測ALC1在不同食管鱗癌細(xì)胞株中表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染ALC1的KYSE30細(xì)胞生長情況

2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測ALC1對KYSE30增殖能力的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了ALC1組的KYSE-30細(xì)胞克隆形成率較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測ALC1對KYSE30細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定表達(dá)ALC1基因的KYSE30細(xì)胞體外侵襲能力顯著增強(qiáng)（圖6A），以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。KYSE30-Vector及KYSE30-ALC1每組隨機(jī)抽取10個(gè)視野計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示過表達(dá)ALC1基因的KYSE30食管癌細(xì)胞的體外侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6B）

2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測ALC1對KYSE-30細(xì)胞遷移能力的影響

KYSE30-Vector及KYSE30-ALC1在0、24和48 h的劃痕實(shí)驗(yàn)圖片見圖7A，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。兩組細(xì)胞在0 h均形成邊緣整齊且銳利的劃痕，劃痕寬度無顯著差異；24、48 h時(shí)，KYSE30-ALC1傷口愈合率明顯高于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示過表達(dá)ALC1基因的KYSE30食管癌細(xì)胞的體外遷移能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7B）。

圖5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測ALC1對KYSE30增殖的影響

圖6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測ALC1對KYSE30侵襲的影響

圖7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測ALC1對KYSE30遷移的影響

3 討論

ALC1（基因庫登記號AF537213），位于1q21.1，基因全長2.98 kb，編碼89kDa分子蛋白［2］，屬于SNF-2類家族，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能［3-4］，是該家族中唯一一個(gè)具有致癌作用的基因。本研究發(fā)現(xiàn)ALC1蛋白在食管癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，對食管癌的生長具有重要作用，可能與其調(diào)控下游基因及促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，ALC1基因通過下調(diào)蛋白p53以及其下游效應(yīng)基因p21、同時(shí)上調(diào)Cdk2及細(xì)胞周期蛋白Cyclin E的表達(dá)，從而促進(jìn)DNA合成及G1期到S期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6-9］。p21蛋白又可以通過C端與增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結(jié)合，阻斷正在復(fù)制的DNA進(jìn)程［10-11］。

本研究中還發(fā)現(xiàn)ALC1在ESCC中的表達(dá)升高與腫瘤的浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。且ALC1蛋白表達(dá)升高的食管鱗癌患者的總生存率明顯低于ALC1蛋白低表達(dá)的食管鱗癌患者。這主要與ALC1具有抗細(xì)胞凋亡的能力和增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力相關(guān)。ALC1通過與孤兒受體超家族Nur77結(jié)合［12-13］抑制Nur77從細(xì)胞核到線粒體的移動(dòng)，從而阻礙細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)的釋放，抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶9和細(xì)胞凋亡蛋白酶3的激活，阻礙細(xì)胞凋亡。從ALC1蛋白中分離的相關(guān)蛋白ARHGEF9可調(diào)控活性GTP狀態(tài)與無活性GDP狀態(tài)的轉(zhuǎn)化。ARHGEF9介導(dǎo)Cdc42激活，從而增強(qiáng)細(xì)胞的游動(dòng)性及誘導(dǎo)絲狀偽足細(xì)胞形成及上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，發(fā)生EMT，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移作用［14-15］。近年來有相關(guān)研究表明ALC1在肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌及結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)［16-20］，并且在細(xì)胞學(xué)方面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明該基因的異常表達(dá)與某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。同時(shí)有研究報(bào)道ALC1表達(dá)與肝癌、結(jié)腸癌的不良預(yù)后正相關(guān)，預(yù)示其可能是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵因素。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ALC1可能作為一個(gè)新的食管癌候選癌基因，其可能與食管癌的進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，對進(jìn)一步了解食管鱗癌的分子發(fā)病機(jī)制具有一定意義。

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