唐 曉，鄧孟勝，鄒 雪，李立芹，3，祝淵智，3，王西瑤，3，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究與開發(fā)中心，四川 成都 611130；2.綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 綿陽 621000；3.作物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(四川農(nóng)業(yè)大學(xué))，四川 成都 611130)

馬鈴薯StDWF1基因克隆及表達(dá)分析

唐 曉1，鄧孟勝1，鄒 雪2，李立芹1，3，祝淵智1，3，王西瑤1，3，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究與開發(fā)中心，四川 成都 611130；2.綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 綿陽 621000；3.作物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(四川農(nóng)業(yè)大學(xué))，四川 成都 611130)

摘 要：DWF1是油菜素內(nèi)酯(BR)生物合成途徑中的關(guān)鍵基因。為探索StDWF1在馬鈴薯生長發(fā)育中的功能，本實驗以馬鈴薯品種費烏瑞它(Favorita)試管苗為材料，克隆StDWF1基因全長序列，開放閱讀框(ORF)為1 704bp，編碼567個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為66.08ku，理論等電點為7.96。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草中瞬時表達(dá)StDWF1，共聚焦顯微鏡觀察顯示StDWF1定位于細(xì)胞質(zhì)。熒光定量分析表明，嫩葉中StDWF1表達(dá)量最高，其次是老葉、匍匐莖、主根、莖、塊莖。對馬鈴薯生育期葉片StDWF1表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明在出苗期表達(dá)量最高。本實驗結(jié)果為進(jìn)一步闡釋BR對馬鈴薯生長發(fā)育的調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；StDWF1；基因克?。槐磉_(dá)分析；亞細(xì)胞定位

馬鈴薯是我國第四大糧食作物，具有生育期短、適應(yīng)性強、營養(yǎng)豐富等特點，對于保障糧食安全、促進(jìn)區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和推動現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)建設(shè)具有重要的現(xiàn)實意義[1]。而馬鈴薯植株的正常生長對塊莖的形成和干物質(zhì)合成具有重要作用，良好的植株長勢是合理增加塊莖產(chǎn)量、提升品質(zhì)的有效途徑，其品質(zhì)和產(chǎn)量均影響著馬鈴薯保障糧食安全和農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)性調(diào)整[2]。因此，分析馬鈴薯生長特點及調(diào)控機制是馬鈴薯生長發(fā)育研究的重要課題。

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，BR)是一類調(diào)控植物生長的固醇類激素，參與多種生理過程，如促進(jìn)植株生長、影響呼吸和生殖器官的發(fā)育、提高植株抗逆性[3-6]。擬南芥中DWF1/DIM是一個雙功能蛋白，催化24-亞甲基膽甾醇合成油菜甾醇，其表達(dá)高低直接影響內(nèi)源BR含量水平，最終調(diào)控植株后續(xù)生理[7]。而其dwf1/dim突變體中，油菜素甾醇合成受阻，BR的水平大量降低[8],植株表現(xiàn)矮化[9]。在DWF1蛋白序列中存在與FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為對氧化還原酶的活性具有重要的影響，并通過Southern雜交分析得到DWF1基因是單拷貝基因[10-11]。對棉花中的DWF1進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhDWF1能夠促進(jìn)纖維及胚珠發(fā)育[12]。在玉米中，對DWF1進(jìn)行RNAi干擾，BR合成受阻，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化[13]。綜上，DWF1在調(diào)控植物生長發(fā)育方面具有重要作用。

本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，BR合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在馬鈴薯休眠與萌芽狀態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用，其合成關(guān)鍵基因DWF1在萌芽時表達(dá)量顯著高于休眠時期[14]，進(jìn)一步利用500 nmol·L-124-eBL處理休眠期馬鈴薯塊莖，證明500 nmol·L-124-eBL可有效促進(jìn)馬鈴薯萌芽生長，并且經(jīng)BL處理種薯，其植株抗性明顯增強、產(chǎn)量顯著提高，因此DWF1可能通過促進(jìn)BR的合成在馬鈴薯生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[15]。

本研究從馬鈴薯品種費烏瑞它中克隆到StDWF1基因全長CDS序列，利用生物信息學(xué)對StDWF1蛋白進(jìn)行理化性、同源性等分析，通過亞細(xì)胞定位明確StDWF1蛋白作用區(qū)域，結(jié)合qRT-PCR分析StDWF1基因在馬鈴薯各組織表達(dá)特異性，并測定不同生育期中StDWF1表達(dá)差異，最終為StDWF1的功能機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬鈴薯品種費烏瑞它試管苗，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究與開發(fā)中心提供。大腸埃希菌感受態(tài)DH5α購自Vazyme Biotech公司，RNA提取試劑盒、DNA凝膠純化回收試劑盒購自天根公司，高保真Pfu酶、限制性內(nèi)切酶、SYBR Green Master mix、DNA Ligation Kit 2.0、克隆載體pMDTM19-T Simple Vector購自TaKaRa公司。引物合成與測序由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯StDWF1基因克隆

根據(jù)擬南芥材料DWF1基因序列，在NCBI同源比對到馬鈴薯BR合成關(guān)鍵基因StDWF1。用天根公司的植物總RNA提取試劑盒提取費烏瑞它試管苗葉片RNA。RNA電泳檢測采用1%的瓊脂凝膠電泳。根據(jù)StDWF1開放閱讀框序列設(shè)計克隆全長引物，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，StDWF1 F:5′-ATGGCAGATGTTCAGGCTCC-3′；StDWF1 R:5′-CTAATCTTCAGGCTCATCAA-3′。按TakaRa公司的cDNA合成試劑盒使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30個循環(huán)；72℃延長10min。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收的PCR產(chǎn)物重組到克隆載體pMD19-T上，然后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，Ampr抗性篩選，并在LB培養(yǎng)基上加4μL IPTG(200mg·mL-1)、40μL X-gal(20mg·mL-1)與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一起涂布涂勻，37℃培養(yǎng)12h，通過藍(lán)白斑篩選，菌液PCR檢測鑒定后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 StDWF1蛋白的生物信息學(xué)分析

引物序列設(shè)計均使用Primer 5.0軟件；將測得的序列拼接后通過NCBI的BLAST比對同源序列(http://blast.Ncbi.Nlm.nih.gov/)；利用在線ProtParam預(yù)測(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)程序預(yù)測氨基酸序列分子量和理論等電點(pI) 、不穩(wěn)定系數(shù)等；通過SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，運用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)和BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分別預(yù)測結(jié)構(gòu)域三維建模和蛋白質(zhì)保守域；使用在線工具PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測StDWF1的亞細(xì)胞定位；通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源序列比對，并通過氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 qRT-PCR分析

提取費烏瑞它成熟期不同組織(根、匍匐莖、老葉、嫩葉、莖及塊莖)和不同生育時期(出苗期、塊莖膨大期、淀粉累積累期、成熟期)的葉片(播種后2周開始取樣，取樣周期為1周)的總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物，按照First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計內(nèi)參EF1αL引物，即EF1αL F： 5′-CTTGTACACCACGCTAAGGAG-3′；EF1αL R:5′-GTCAATGCAAACCATTCCTTG-3′。依據(jù)全長cDNA序列設(shè)計StDWF1定量引物DWF1-P1： 5′-AGTTGGTGGACTTTCTTCTTTC-3′；DWF1-P2:5′-TTCTGCATTCCTCTGTTCAAG-3′。定量PCR反應(yīng)體系為：4.5μL cDNA，上下游引物(10μmol·L-1)各0.25μL，2×Ssofast Eva Green 5μL，ddH2O補足10μL。反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 5s，55℃ 5s，39個循環(huán)；95℃ 10s，65～95℃做熔解曲線，各溫度以0.5℃上升，并停5 s。每個試驗樣品設(shè)置3個重復(fù)，基因表達(dá)量用2-△△Ct方法在Bio-Rad CFX Manager V軟件上進(jìn)行分析，測定StDWF1在馬鈴薯不同組織部位和葉片不同生育時期的表達(dá)量。

1.2.4 亞細(xì)胞定位

根據(jù)StDWF1的全長CDS序列設(shè)計帶BsaⅠ和Eco31Ⅰ酶切位點引物，DWF(+)：5′-CAGTCGTCTCACAACATGGCAGATGTTCAGGCTCC-3′；DWF1(-):5′-CAGTCGTCTCATACAATCTTCAGGCTCATCAACTT-3′，對全長cDNA序列進(jìn)行擴增，并對PCR產(chǎn)物和pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定后提取重組質(zhì)粒。將構(gòu)建完成的pBWA(V)HS-DWF1-Glosgfp通過農(nóng)桿菌浸染法[16]轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，對本氏煙草進(jìn)行浸染，弱光培養(yǎng)2d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光融合蛋白表達(dá)部位。

2 結(jié)果與分析

2.1 StDWF1基因克隆

總RNA電泳檢測表明18S和28S條帶清晰，分光光度計測定D260/D280和D260/D230均為2.0，RNA質(zhì)量良好。以總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，電泳結(jié)果在約1 700bp位置有清晰條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與pMD19-T載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。采用菌落PCR方法鑒定陽性克隆，隨機挑選3個重組質(zhì)粒至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果表明目的片段大小為1 704bp(圖2)。

2.2 StDWF1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 氨基酸序列分析

M，Marker 4500bp；1，StDWF1基因。M，Marker 4500bp;1，StDWF1 gene PCR product.圖1 StDWF1的克隆Fig.1 Cloning of StDWF1

將StDWF1與其他物種DWF1進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示與番茄同源性高達(dá)98%，其次是旋蒴苣苔85%和柑橘85%。使用DNAMAN軟件對番茄(NP_001234550.1)、旋蒴苣苔(KZV24322.1)以及柑橘(XP_006437509.1)等進(jìn)行多序列對比(圖3)，結(jié)果表明馬鈴薯StDWF1序列與其他DWF1家族基因具有較高同源性。將StDWF1序列BLAST分析其保守區(qū)域，結(jié)果顯示StDWF1具有FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域，位于第48～231位氨基酸。同時該序列還具有3個可以作為跨多個結(jié)構(gòu)域的模型結(jié)構(gòu)域，它們沒有被分配到任何結(jié)構(gòu)域家族，分別為GlcD、FAD_lactone_ox和PLN02805。

2.2.2 StDWF1的理化性質(zhì)分析

通過ProtParam軟件在線預(yù)測分析StDWF1蛋白理化性質(zhì)，分析結(jié)果表明，蛋白(C3018H4623N783O844S22)由567個氨基酸組成，總相對分子質(zhì)量為66.08ku，其中負(fù)電荷氨基酸75個，正電荷氨基酸77個，蛋白質(zhì)理論等電點為7.96，不穩(wěn)定系數(shù)為36.66，該蛋白可能是一個穩(wěn)定的弱堿性蛋白?？偲骄H水系數(shù)為-0.404，預(yù)測該蛋白屬于親水性蛋白。

2.2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

DWF家族是由FAD作為輔基時發(fā)生氧化還原反應(yīng)所對應(yīng)的酶構(gòu)成的，因此所克隆的基因正確。在SOPMA在線軟件上分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占到39.15%、29.28%，其次為23.81%β-折疊和7.76%β-轉(zhuǎn)角(圖4)。通過SWISS-MODEL在線分析建立三維結(jié)構(gòu)模型圖(圖5)，并將結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相對比，結(jié)果較為統(tǒng)一。

2.2.4 StDWF1序列對比和進(jìn)化樹分析

為確立StDWF1在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，用氨基酸序列在NCBI與其他物種序列比對，大部分為雙子葉植物。利用進(jìn)化樹分析物種間親緣關(guān)系(圖6)，同屬于茄科植物的馬鈴薯、番茄、辣椒和煙草屬于同一分支，同屬于薔薇科的蘋果和梨在同一分支，同屬于豆科的綠豆、紅小豆、菜豆、大豆以及木豆也在同一分支，其他科、屬的植物也按此聚類，與現(xiàn)有分類系統(tǒng)相符。

圖3 StDWF1序列與其他DWF1氨基酸多重序列對比Fig.3 Multiple alignment of DWF1 amino acids sequence

圖4 StDWF1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of StDWF1

圖5 StDWF1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted tertiary structure of StDWF1

2.3 亞細(xì)胞定位

以總RNA為模板，通過DWF(+)和DWF(-)引物擴增目的片段，酶切后與pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp連接，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒酶切鑒定，并送測序，序列BLAST后證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將鑒定后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入GC3101中，對幼嫩煙草進(jìn)行融合蛋白瞬時表達(dá)，觀察發(fā)現(xiàn)空載熒光信號粗細(xì)不一且有原點，說明其可能遍布細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜(圖7-A)，而含有目的基因的熒光信號呈不均勻線狀，說明StDWF1被定位于細(xì)胞質(zhì)(圖7)。

2.4 StDWF1基因組織表達(dá)分析

實時熒光定量分析馬鈴薯根、匍匐莖、塊莖、莖、老葉及嫩葉StDWF1基因表達(dá)(圖8)。結(jié)果顯示，在5種組織中均有表達(dá)。經(jīng)顯著性分析(P≤0.05)，StDWF1基因在嫩葉、老葉和匍匐莖中表達(dá)量顯著高于其他組織部位，其次是塊莖、根、莖。表明StDWF1主要在費烏瑞它嫩葉、老葉和匍匐莖中表達(dá)，其各組織表達(dá)存在顯著差異。

2.5 馬鈴薯生長不同時期葉片中StDWF1的表達(dá)分析

對葉片每個時期進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)StDWF1基因在各生長階段均有表達(dá)，利用顯著性分析(P≤0.05)將整個生育期分為3個階段：第一階段(0～14d)為馬鈴薯出苗期，葉片中StDWF1基因表達(dá)量最高，其高量的表達(dá)快速催化合成BR等生長類物質(zhì)，促進(jìn)幼苗營養(yǎng)生長；第二階段(21～28d)為幼苗期與塊莖形成期，植株生長處于平穩(wěn)，大量葉片StDWF1穩(wěn)定催化合成BR等生長物質(zhì)，用于植株生長，此時葉片中StDWF1表達(dá)量較出苗期降低；第三階段(35～56d)包括馬鈴薯塊莖增長期與淀粉積累期，此時整個葉片生長趨于穩(wěn)定，StDWF1表達(dá)下降至最低，對BR等促生長物質(zhì)需求量減少，而主要依靠光合作用向塊莖大量輸送物質(zhì)，促進(jìn)塊莖淀粉合成與積累(圖9)。

圖6 StDWF1的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of StDWF1

A，空載熒光信號；B，目的基因熒光信號。A，Contrast fluorescence signal;B，F(xiàn)luorescent signal of target gene.圖7 StDWF1-GFP在煙草中的瞬時表達(dá)Fig.7 Transient expression of StDWF1-GFP in tobacco

不同柱形上沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars without the same letters showed the significant difference(P<0.05).The same as below.圖8 馬鈴薯不同組織部位中StDWF1基因的表達(dá)分析Fig.8 Analysis of relative expression of StDWF1 in different tissues of potato

圖9 StDWF1基因在馬鈴薯葉片不同時期表達(dá)分析Fig.9 Analysis of relative expression of StDWF1 in different periods of potato

3 討論

DWF1基因多步催化BR合成，是調(diào)節(jié)BR合成的關(guān)鍵基因。而BR為植物中第六大激素，調(diào)控植株生長、種子萌發(fā)以及抗性脅迫等重要生長發(fā)育過程，前期研究表明BR相關(guān)基因SMT1[17]、BRI[18]、BIN2[19]等均通過調(diào)節(jié)BR合成與信號影響植物生長發(fā)育。本實驗克隆BR合成的重要基因StDWF1，并對其進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化關(guān)系分析，再進(jìn)一步研究了該蛋白的表達(dá)定位和基因在馬鈴薯各組織中的表達(dá)特異性以及在馬鈴薯植株各生育期的表達(dá)變化，研究StDWF1表達(dá)在調(diào)控馬鈴薯生長發(fā)育中的重要作用。

本實驗從費烏瑞它葉片中克隆了StDWF1全長編碼序列1 704bp，與前期馬鈴薯全基因組和轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果一致。氨基酸同源序列比對和保守域分析，發(fā)現(xiàn)StDWF1蛋白包含高度保守的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域[10]，是催化氧化還原反應(yīng)的重要功能域[8]，前期結(jié)果表明FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域由α+β兩個子域構(gòu)成[13]，經(jīng)預(yù)測分析表明馬鈴薯FAD同樣由以上兩個子域構(gòu)成，證實StDWF1與擬南芥、水稻、玉米等植物中DWF1功能存在高度同源性，在催化BR合成上具有重要的作用。進(jìn)一步運用鄰比法分析StDWF1在植物進(jìn)化中的親緣關(guān)系，結(jié)果表明StDWF1與同科植物番茄、煙草親緣關(guān)系最近，與番茄StDWF1序列同源性高達(dá)98%，而與楊樹、綠豆等植物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，符合植物各科屬在進(jìn)化中的關(guān)系，而其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度也體現(xiàn)了各同源蛋白與StDWF1蛋白的功能相似性，與同科植物番茄、煙草DWF1相比，三者間DWF1的功能相似性更高，為以后StDWF1功能的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

前期研究表明，催化植物甾醇最后階段合成酶主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，對擬南芥和玉米的DWF1進(jìn)行GFP-DWF1/DIM融合蛋白煙草瞬時表達(dá)，結(jié)果均表明DWF1定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[7，13]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)玉米DWF1蛋白精確定位在光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。而本實驗利用PSORT生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StDWF1亞細(xì)胞定位于微體上，與前期DWF1亞細(xì)胞定位結(jié)果存在明顯差異，進(jìn)一步在煙草葉片中瞬時表達(dá)StDWF1-GFP融合蛋白，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)StDWF1大量分布于邊緣細(xì)胞質(zhì)中，而微體也主要分布在細(xì)胞質(zhì)邊緣，包含多種催化氧化還原的酶體，煙草亞細(xì)胞定位結(jié)果與預(yù)測定位于微體結(jié)果一致，但具體定位仍需深入分析，而與玉米DWF1定位于光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在一定差異，表明各物種間DWF1雖均能催化氧化還原反應(yīng)，但其蛋白功能定位也存在差異。

組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，StDWF1在馬鈴薯各個組織部位均有表達(dá)，并在幼嫩部位表達(dá)量較高，與DWF1在玉米、豌豆和棉花中的表達(dá)模式一致[12，20-22]。研究證明，BR合成酶主要集中在葉片表皮組織，參與葉片內(nèi)囊體中光合鏈的電子傳遞[10，23-24]，因此本實驗發(fā)現(xiàn)，StDWF1在葉片中的表達(dá)量明顯高于根、莖等其他組織。另外，對馬鈴薯匍匐莖分析發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)均高于根、莖等組織，體現(xiàn)了DWF1在馬鈴薯植株中表達(dá)的特殊性，匍匐莖需大量合成BR等生長物質(zhì)，促進(jìn)塊莖的形成與膨大以及后期的干物質(zhì)積累。為明確StDWF1在馬鈴薯生長發(fā)育中的作用，利用qRT-PCR分析不同發(fā)育時期葉片中基因表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出苗期StDWF1的表達(dá)水平最高，證明StDWF1催化BR等相關(guān)生長物質(zhì)的合成，促進(jìn)馬鈴薯幼苗的快速營養(yǎng)生長，故該時期基因表達(dá)旺盛，這與玉米、棉花中發(fā)育旺盛時期的表達(dá)趨勢一致[19，23]，均表明了DWF1對植株生長發(fā)育的重要調(diào)控作用。而隨著馬鈴薯的生長，該基因在葉片中的表達(dá)量逐步下降，維持相對穩(wěn)定的水平，主要是維持葉片中正常的新陳代謝[25-26]；另一方面，葉片中DWF1表達(dá)的下降，可能通過其他部位合成彌補葉片合成減少，可見，BR在馬鈴薯各組織中的合成是不斷變化的，且有可能BR不存在各組織間長距離運輸情況[13]。

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CloningandexpressionanalysisofStDWF1inSolanumtuberosum

TANG Xiao1，DENG Mengsheng1，ZOU Xue2，Li Liqin1，3，ZHU Yuanzhi1，3，WANG Xiyao1，3，*

(1.PotatoResearchandDevelopmentCenter，CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China;2.MianyangAcademyofAgriculturalSciences，Mianyang621000，China;3.NationalDemonstrationCenterforExperimentalCropScienceEducation(SichuanAgriculturalUniversity)，Chengdu611130，China)

Abstract:TheDWF1 is a key gene in brassinosteroid(BR) biosynthesis pathway.To explore the function ofStDWF1 in the growth and development of potato，this experiment was based on the potato variety Favorita test-tube plantlets，and we cloned the full-length sequence ofStDWF1 gene.The open reading frame(ORF) ofStDWF1 gene was 1 704bp，and encoded 567 amino acids.The molecular weight of protein was 66.08ku，and the isoelectric point(pI) was 7.96.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transient expression was carried out in tobacco，and laser scanning confocal microscopy showed that potato StDWF1 was located in cytoplasm.Fluorescence quantitative analysis showedStDWF1 expression quantity was the highest in new leaves，followed by old leaves，stolon，roots，stems and tubers.We analyzed the expression ofStDWF1 in potato leaves at the growth period，and the results showed that the highest expression quantity was in potato seedling stage.The results of this experiment laid the theoretical foundation for further interpreting the regulation mechanism of BR in the potato growth and development.

Key words:potato;DWF1;gene cloning;expression analysis;subcellular localization

中圖分類號：S532

A

文章編號：1004-1524(2018)06-0909-09

收稿日期：2018-01-04

基金項目：四川省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)經(jīng)費(03120233)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研興趣培養(yǎng)計劃(ky2016247)

作者簡介：唐曉(1992—)，男，四川成都人，碩士研究生，研究方向為馬鈴薯分子生物學(xué)。E-mail:354550329@qq.com

，王西瑤，E-mail：1357664714@qq.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.04

(責(zé)任編輯張 韻)