柴春霞，王 僑，賴雅蘭，徐伊璇，文心田，曹三杰，黃小波，文翼平，趙 勤，伍 銳

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心，四川 成都 611130)

豬乙型腦炎病毒SCYA201201株感染小鼠后突破血腦屏障能力研究

柴春霞，王 僑，賴雅蘭，徐伊璇，文心田，曹三杰，黃小波，文翼平，趙 勤，伍 銳*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心，四川 成都 611130)

摘 要：將豬乙型腦炎病毒SCYA201201株(F122代次，弱毒株)腦內(nèi)接種小鼠，評(píng)估該病毒株對(duì)小鼠的致病性。通過(guò)腹腔接種小鼠，分別在接種后6、12、18、24h觀察小鼠腦部病理變化，同時(shí)利用熒光定量PCR方法檢測(cè)其血液、腦組織E基因拷貝數(shù)，探究該毒株突破小鼠血腦屏障的能力，從而評(píng)估SCYA201201株(F122代次)作為弱毒活疫苗的潛力。結(jié)果顯示，SCYA201201株(F122代次)高度弱化，對(duì)乳鼠的腦內(nèi)半數(shù)致死量(LD50)僅為4×105PFU·40μL-1。該毒株腹腔接種24h內(nèi)，小鼠腦部未出現(xiàn)病理變化，且熒光定量PCR檢測(cè)為陰性，表明該毒株不能突破小鼠的血腦屏障，具有很高的安全性。

關(guān)鍵詞：豬乙型腦炎病毒；半數(shù)致死量；熒光定量PCR；血腦屏障

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是一種經(jīng)蚊蟲傳播的人畜共患傳染病，病原體是日本乙型腦炎病毒(JEV)。JEV屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，包括衣殼蛋白C、膜蛋白M、囊膜蛋白E等3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5等7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。豬是JEV主要傳染源和最重要的自然增殖動(dòng)物。豬感染JEV雖然不會(huì)引起較高的死亡率，但是會(huì)引起種豬的繁殖障礙，如母豬發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱仔以及木乃伊胎，公豬發(fā)生急性睪丸炎或者不育[2]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。

JEV的E基因與病毒吸附穿入致病和機(jī)體宿主的免疫應(yīng)答作用密切相關(guān)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體，為免疫原性蛋白，前膜蛋白prM和E蛋白具有免疫原性，E蛋白在決定病毒致病力上起著重要作用。根據(jù)E基因核苷酸序列的差異，可以將JEV分為5個(gè)基因型：即基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型[3]。基因Ⅰ型主要來(lái)源于泰國(guó)北部、柬埔寨、韓國(guó)；基因Ⅱ型來(lái)自泰國(guó)南部、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、澳大利亞；基因Ⅲ型主要分離于亞洲溫帶地區(qū)，如日本、中國(guó)、印度等地；基因Ⅳ型主要存在于印度尼西亞；基因Ⅴ型出現(xiàn)得少，在馬來(lái)西亞、中國(guó)和韓國(guó)分離得到。在我國(guó)，JEV的基因型主要是Ⅰ型和Ⅲ型[4]，1979年我國(guó)研究人員分離出Ⅰ型JEV毒株，在我國(guó)遼寧[5]等多地出現(xiàn)，數(shù)量逐漸增多，危害也越來(lái)越大。在我國(guó)應(yīng)用廣泛的是WH1株的鼠腦滅活苗和SA14-14-2株減毒活疫苗，這2個(gè)毒株均屬于基因Ⅲ型。目前我國(guó)尚無(wú)商品化的基因Ⅰ型疫苗，對(duì)基因Ⅰ型疫苗的研究刻不容緩。

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)由腦微管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的緊密連接、完整的肌膜、周細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞腳圍成的神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成[6]。乙腦病毒主要通過(guò)破壞內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接[7]穿越血腦屏障入侵腦部，破壞神經(jīng)細(xì)胞與腦內(nèi)微環(huán)境，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，因此，檢測(cè)乙型腦炎病毒早期突破血腦屏障的能力，可作為乙型腦炎減毒活疫苗安全性評(píng)估的有效手段。本實(shí)驗(yàn)選用BHK-21細(xì)胞上的連續(xù)傳代培養(yǎng)、毒力致弱的F122代次乙腦病毒SCYA201201株接種小鼠，測(cè)定小鼠腦內(nèi)半數(shù)致死量(LD50)，熒光定量PCR檢測(cè)腹腔接種24h內(nèi)F122代病毒在血液、腦組織中的病毒含量與腦組織病理變化，對(duì)該毒株的安全性進(jìn)行基礎(chǔ)評(píng)估，為后續(xù)將SCYA201201株繼續(xù)致弱制備弱毒疫苗提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

豬源乙型腦炎病毒(SCYA201201株)，于2012年8月從四川雅安某豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒腦組織中分離鑒定，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心保存。F122代次乙腦病毒，由SCYA201201株乙腦病毒在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代致弱得到。BHK-21細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心凍存。3周齡SPF昆明小鼠購(gòu)自四川成都達(dá)碩有限公司。

1.2 主要試劑

RNAsimple Total RNA Kit、Real Master Mix(SYBR Green)FP202均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 乙腦病毒滴度的測(cè)定

將生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞按常規(guī)消化后接種于6孔板中，每孔2mL。在接種病毒液之前將病毒原液用DMEM營(yíng)養(yǎng)液按照10倍梯度稀釋至合適稀釋倍數(shù)。將稀釋好不同梯度的病毒液接種于6孔板中，每孔0.5mL，并設(shè)置1孔為對(duì)照組，37℃孵育，1.5h后吸取孵育液，每孔加入2mL的甲基纖維素維持液，37℃培養(yǎng)4～6d，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，吸取維持液，加入5%甲醛固定15min，再加入1%結(jié)晶紫染色15～20min，數(shù)出空斑數(shù)量，計(jì)算出病毒的滴度(PFU·mL-1)。

1.4 乳鼠LD50測(cè)定

將F122代病毒液10倍梯度稀釋后，取10-1～10-5病毒稀釋液接種小鼠(平均體質(zhì)量7～8g)，每個(gè)稀釋度接種5只，每只腦內(nèi)注射40μL，棄去2d內(nèi)死亡的小鼠，連續(xù)觀察14d，記錄小鼠死亡情況并以Reed-Muench法計(jì)算LD50。

1.5 小鼠腹腔接種及樣品采集

將3周齡SPF昆明雌鼠隨機(jī)分成2組，每組12只，其中1組作為對(duì)照。SCYA201201株接種組按3.58 LD50腹腔接種，對(duì)照組接種PBS。接種后6、12、18、24h分別取小鼠血液及腦組織，觀察腦部病理變化。

1.6 熒光定量PCR E基因拷貝數(shù)的測(cè)定

將取好的腦組織和血液按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的RNA simple Total RNA Kit說(shuō)明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)曲線參照Yuan等[8]文章所示乙腦病毒檢測(cè)方法：將實(shí)驗(yàn)室已制備好的E基因標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，以濃度梯度起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值為X軸，相應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)值為Y軸作回歸曲線，由Mini opticon Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)得出定量PCR的動(dòng)力學(xué)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的表達(dá)式。熒光定量反應(yīng)體系參照Real Master Mix(SYBR Green)FP202試劑盒說(shuō)明。E基因引物序列：F，5′-CATTGGAGCCACTTGGGTG-3′；R，5′-TTGTGGGCTTCTCCTGTCG-3′。反應(yīng)體系20μL:RealMasterMix/SYBR solution 9.0μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 8.4μL。反應(yīng)程序：95℃ 2min；95℃ 15s，57℃ 20s，68℃ 20s，79℃ 10s，39個(gè)循環(huán)；65～95℃溶解循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙腦病毒滴度的測(cè)定

將F121代乙腦病毒[感染復(fù)數(shù)(MOI)0.01]接種于鋪滿單層的BHK-21細(xì)胞中，24h細(xì)胞沒有明顯變化，到48h細(xì)胞由梭形變圓縮，大面積脫落堆積(圖1)，并收毒。收取的F122代乙腦病毒液在BHK-21細(xì)胞上作空斑實(shí)驗(yàn)(圖2)，培養(yǎng)至3.5d，細(xì)胞出現(xiàn)變形裂解，結(jié)晶紫染色后，計(jì)數(shù)蝕斑數(shù)目，測(cè)定F122代病毒的滴度為4.2×107PFU·mL-1。

A，BHK-21陰性對(duì)照；B，接毒48h細(xì)胞病變。A，Control of BHK-21;B，Cytopathies of injection at 48h.圖1 豬乙型腦炎F122代次毒株接種BHK-21的細(xì)胞病變Fig.1 Cytopathies of BHK-21 inoculated with F122 generation of porcine JEV

A，F(xiàn)122代次蝕班；B，空白對(duì)照。A，Plaque of F122 strain;B，Negative control.圖2 豬乙型腦炎病毒F122代次毒株接種BHK-21細(xì)胞后的蝕斑觀察Fig.2 Results of plaque after inoculation with F122 generation of porcine JEV in BHK-21

2.2 小鼠LD50的測(cè)定

將病毒10倍梯度稀釋腦內(nèi)接種后：在10-1稀釋倍數(shù)下小鼠在第5天開始出現(xiàn)麻痹、四肢抽搐，并開始死亡，第6天5只全部死亡；在10-2稀釋倍數(shù)下小鼠在第5天出現(xiàn)四肢間歇性抽搐癥狀，在第6天死亡4只，第7天死亡1只；在10-3稀釋倍數(shù)下小鼠第6天開始出現(xiàn)麻痹等神經(jīng)癥狀，第7天死亡4只；在10-4稀釋倍數(shù)下小鼠也出現(xiàn)了抽搐等癥狀，在第7天、第8天各死亡1只；在10-5稀釋倍數(shù)下小鼠沒有出現(xiàn)死亡。通過(guò)統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)據(jù)，按照Reed-Muench法計(jì)算出F122代乙腦病毒對(duì)乳鼠的半數(shù)致死量(LD50)為10-3.7·40μL-1(4×105PFU·40μL-1)。

2.3 腦部組織病變觀察結(jié)果

將F122代乙腦病毒按3.58 LD50腹腔接種小鼠后，分別在6、12、18、24h獲取小鼠腦部，并記錄其顱骨外膜及腦組織的病理眼觀變化。如圖3所示，有顱骨外膜的小鼠從接種病毒后6～24h內(nèi)與PBS對(duì)照組并無(wú)明顯差異。

將腦部顱骨去掉、腦組織完全暴露后，觀察發(fā)現(xiàn)，組織形態(tài)與PBS對(duì)照組基本一致(圖4)，并無(wú)感染乙腦病毒的非化膿性腦炎病理變化，如腦軟膜模糊、腦實(shí)質(zhì)充滿斑點(diǎn)狀出血點(diǎn)或腦灰質(zhì)出血。

A，6h；B，12h；C，18h；D，24h.圖3 顱骨外膜病理變化Fig.3 Histopathological changes of skull epicardium

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以JEVE基因標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，由Miniopticon Detection System得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.292X+39.1，拷貝數(shù)為3.2×10xcopies·μL-1，擬合度r2為0.995。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)乙腦病毒E基因拷貝數(shù)

根據(jù)讀取到的不同時(shí)間點(diǎn)血液和腦組織病毒cDNA模板Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得到模板的初始拷貝數(shù)值，再轉(zhuǎn)換為初始模板拷貝數(shù)的平均值對(duì)數(shù)值(lg copies)，結(jié)果如圖5所示。SCYA201201組在6h腦組織和血液中病毒含量均高于PBS組，12h腦組織病毒含量較6h顯著(P<0.05)下降，并低于PBS組，血液中病毒含量在6～12h變化并不明顯，18～24h腦組織病毒含量緩慢下降，且仍低于PBS組，血液中病毒含量在18h最低，低于PBS組，24h腦組織和血液中病毒含量基本與PBS組持平。總體來(lái)看，F(xiàn)122代乙腦病毒在感染小鼠早期沒有突破血腦屏障。

圖5 病毒感染小鼠后不同時(shí)間腦組織(A)和血液(B)中的病毒拷貝數(shù)Fig.5 Virus copies of E gene in brain(A) and blood(B) at different time

3 討論

乙腦病毒會(huì)嚴(yán)重影響人畜中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并引起腦炎癥狀。人或動(dòng)物被感染后，病毒侵入體內(nèi)并迅速進(jìn)入血流，在外周血管中增殖，隨后進(jìn)入到神經(jīng)外組織，特別是其網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中。病毒經(jīng)脊液或內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞感染或血源路線進(jìn)入中樞系統(tǒng)(CNS)[9]。當(dāng)病毒感染的劑量大或具有極高毒力時(shí)，病毒可能突破血腦屏障(BBB)，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在腦組織內(nèi)大量增殖，產(chǎn)生病變，引起神經(jīng)癥狀。因此，對(duì)乙腦病毒在早期突破血腦屏障作探究很有必要。通過(guò)分析熒光定量PCR結(jié)果，并結(jié)合腦組織和血液的共同分析可知，病毒首先進(jìn)入血液后，在外周血管中迅速增殖，所以在6～12h血液中含量較高，而病毒也可能隨著血流暫時(shí)性地進(jìn)入大腦血管中，因此在6h測(cè)得腦組織中病毒含量亦較高，但隨著時(shí)間推移，機(jī)體對(duì)此會(huì)做出免疫反應(yīng)，而且F122代次的病毒是在BHK-21細(xì)胞傳代毒力致弱的，病毒會(huì)被逐步消滅，所以最終無(wú)法在24h內(nèi)透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙造成血腦屏障損傷。結(jié)合腦部解剖結(jié)果，也沒有出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的典型病變：大腦皮質(zhì)、中腦、腦橋和基底核的病變；神經(jīng)細(xì)胞變性與壞死，形成軟化灶；血管充血，形成血管套；腦實(shí)質(zhì)斑點(diǎn)狀的出血點(diǎn)等[10]。先前研究表明，乙腦病毒與西尼羅病毒、蜱傳腦炎病毒一樣，中樞系統(tǒng)的感染時(shí)間晚于血腦屏障發(fā)生功能障礙時(shí)間[11-13]，本研究結(jié)果也間接驗(yàn)證了這一結(jié)論。

我國(guó)早期成功研制的日本乙型腦炎病毒的鼠腦和雞胚疫苗，由于鼠腦疫苗中含有動(dòng)物腦組織成分，不良反應(yīng)較重，少數(shù)人群可引起過(guò)敏性休克、變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎等[14-15]，后逐步被淘汰。20世紀(jì)80年代后期，我國(guó)成功研制的乙腦減毒活疫苗采用了具有良好免疫原性的減毒株SA14-14-2[15-16]，通過(guò)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備的活疫苗。有報(bào)道顯示，當(dāng)前用于人的唯一乙腦弱毒活疫苗JEV-L株，接種疫苗的40%會(huì)有過(guò)敏反應(yīng)，2%出現(xiàn)神經(jīng)反應(yīng)，2.5%出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)[17]。疫苗的安全性是能否廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵，對(duì)于減毒活疫苗，毒株的毒力、安全性、免疫原性等都是研究的重點(diǎn)。針對(duì)目前我國(guó)乙腦病毒基因型流行情況，以及疫苗研發(fā)進(jìn)展，以基因Ⅰ型的豬源SCYA201201株作為研究主體，將該毒株細(xì)胞傳代致弱，目前已經(jīng)傳到F122代次，已獲得其病毒細(xì)胞滴度，并使用昆明鼠測(cè)得乳鼠LD50的指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，昆明品系的小鼠是黃病毒科病毒研究的模型動(dòng)物[18]，可為新的減毒活疫苗做準(zhǔn)備。JEV在BHK-21細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)，使病毒在BHK-21細(xì)胞的適應(yīng)性增強(qiáng)，病毒的細(xì)胞滴度明顯提高，病毒細(xì)胞毒的滴度從F16代病毒的104.71PFU·mL-1提高到F122代病毒的107PFU·mL-1，乳鼠的半數(shù)致死量LD50也從F16代10-4.22·40μL-1增加到F122代10-3.7·40μL-1。病毒的滴度與半數(shù)致死量的大小成正相關(guān)，從上述數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，SCYA201201株毒力是逐漸減弱的，結(jié)合熒光定量PCR結(jié)果，F(xiàn)122代乙腦病毒無(wú)法在24h內(nèi)突破血腦屏障，并且腦部沒有眼觀病理變化。因此，本研究可為SCYA201201株作為疫苗應(yīng)用的安全性研究做一定鋪墊，也為后續(xù)將其開發(fā)成弱毒活疫苗奠定了研究基礎(chǔ)。

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Abilitytobreakthroughblood-brainbarrierofporcineJapaneseencephalitisvirusSCYA201021strainafterinfectioninmice

CHAI Chunxia，WANG Qiao，LAI Yalan，XU Yixuan，WEN Xintian，CAO Sanjie，HUANG Xiaobo，WEN Yiping，ZHAO Qin，WU Rui*

(ResearchCenterofSwineDisease，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Abstract:In the present study，SPF Kuming mice were inoculated with SCYA201021 strain(F122 generation，attenuated strain of porcine Japanese encephalitis virus) by intracerebral injection in order to evaluate its potential value as the attenuated live vaccine，and its ability to break through the blood-brain barrier in mice.After infection in mice，pathological changes in mice brain were observed，and theEgene copes were measured by fluorescent quantitative PCR in the blood and brain at 6，12，18，24h after inoculation，respectively.The results indicated that the virulence of SCYA201021 strain(F122 generation) was significantly weakened as the half lethal does(LD50) in suckling mice brain was only 4×105PFU·40μL-1.Moreover，the mice did not show pathological changes in the brain during the 24h after intraperitoneal injection，and the quantitative PCR results were negative，indicating that the SCYA201021 strain could not break through the blood-brain barrier in mice and the SCYA201021 strain had high safety.

Key words:porcine Japanese encephalitis virus;half lethal does;fluorescent quantitative PCR;blood-brain barrier

中圖分類號(hào)：S855.3

A

文章編號(hào)：1004-1524(2018)06-0926-06

收稿日期：2017-10-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500403)

作者簡(jiǎn)介：柴春霞(1993—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士，主要從事豬乙型腦炎病毒研究。E-mail:chaichunxia_ccx@126.com

，伍銳，E-mail:wurui1977@163.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.06

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