何 羽，田 浤，戴 鑫，姚文兵，高向東

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)是一個(gè)185 kD的跨膜受體，具有酪氨酸激酶活性。HER2受體通過(guò)與其他受體結(jié)合，激活具有酪氨酸激酶功能的胞內(nèi)區(qū)，誘導(dǎo)信號(hào)通路活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖[1]。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了HER2受體的過(guò)表達(dá)，其中約有20%～30%的乳腺癌患者是HER2高表達(dá)[2]。HER2高表達(dá)的腫瘤患者具有生存時(shí)間短、預(yù)后較差、容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，因此HER2是一個(gè)理想的抗腫瘤靶點(diǎn)。

目前，以HER2為靶點(diǎn)的相關(guān)藥物主要包括單克隆抗體曲妥珠單抗和小分子抑制劑拉帕替尼[3-4]。但是這兩類(lèi)藥物均存在一定的耐藥性以及細(xì)胞毒性[5-7]。與被動(dòng)免疫應(yīng)答相比，主動(dòng)免疫應(yīng)答可以產(chǎn)生多克隆抗體，解決單克隆抗體的耐藥性問(wèn)題，并且可以產(chǎn)生免疫記憶效應(yīng)，防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)[8]。因此，HER2腫瘤疫苗是一種有潛力的治療藥物。目前已有多種以HER2為靶點(diǎn)的DNA、多肽、蛋白疫苗進(jìn)入臨床研究，然而大部分HER2腫瘤疫苗終止于臨床Ⅱ期研究，原因是HER2是自身蛋白，免疫原性低，難以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[9-10]。因此，如何提高HER2腫瘤抗原的免疫原性，打破機(jī)體免疫耐受是HER2腫瘤疫苗設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，利用遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)，在蛋白質(zhì)上連接具有免疫原性的非天然氨基酸可以有效打破自身蛋白的免疫耐受，產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[11]。研究表明，將對(duì)硝基苯丙氨酸(pNO2Phe)引入到B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)和小鼠補(bǔ)體因子C5a中，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生與內(nèi)源性BAFF和C5a蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的IgG抗體[12-14]。

本研究采用HER2胞外23～146片段作為原型分子Wt HER2，利用遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)在其5、26、79位上定點(diǎn)引入pNO2Phe獲得改構(gòu)體(pNO2Phe5HER2、pNO2Phe26HER2、pNO2Phe79HER2)，通過(guò)檢測(cè)抗體滴度篩選出免疫原性最高的pNO2Phe79HER2作為疫苗候選分子，對(duì)pNO2Phe79HER2疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行分析，證明了pNO2Phe79HER2誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠識(shí)別完整HER2的胞外區(qū)序列，并可以通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)裂解HER2+B16F10腫瘤細(xì)胞，提示pNO2Phe79HER2可以作為靶向HER2的腫瘤疫苗候選分子。

1 材 料

1.1 菌種和質(zhì)粒

E.coliBL21(DE3)、pET28a(+) Vector均為中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試 劑

Prime STAR DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoI、Hind III、BspH I(大連TaKaRa公司)；pNO2Phe(上海吉爾生化有限公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中山金橋生物科技有限公司)；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，北京索萊寶科技有限公司)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Sigma公司)；小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)；BCA試劑盒、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動(dòng) 物

清潔級(jí)C57BL/6雌性小鼠(6～8周齡)購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3(上海斯信生物科技有限公司)；HER2高表達(dá)的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株HER2+B16F10(中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)。

2 方 法

2.1 Wt HER2基因的克隆

根據(jù)HER2( GenBank 登錄號(hào):M11730.1)序列，選擇胞外23～146序列片段，運(yùn)用DNAWORK在線軟件，參考大腸埃希菌的密碼子偏愛(ài)性，設(shè)計(jì)10條引物(見(jiàn)表1)。

用Prime STAR DNA聚合酶進(jìn)行overlapping PCR，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪PCR以P2～P9為引物，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，回收并純化PCR產(chǎn)物Ⅰ。第二輪PCR以P1、P10為引物，以PCR產(chǎn)物Ⅰ為模板，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，回收并純化PCR產(chǎn)物Ⅱ。

2.2 突變體HER2基因的克隆

在Wt HER2抗原片段DNA序列的基礎(chǔ)上，將第5位Thr密碼子ACC、第26位His密碼子CAT和第79位Ile密碼子ATT分別置換為琥珀密碼子TAG，利用DNAWORK在線軟件對(duì)突變體HER2進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(見(jiàn)表2)。

Table1 Primer sequences of Wt HER2 designed by DNAWORK software

PrimerSequences(5'?3')P1ATCATGACCCAGGTGTGCACCGGCP2AGATGGGTTTCCGGTGACGCCGGCAGACG-TAACTTCAT-ATCGGTGCCGGTGCACACCTP3TCACCGGAAACCCATCTGGATATGCT-GCGTCATCTGTA-TCAGGGCTGCCAAGTGGTGCP4AAGCTCGCATTGGTCGGCAGATACGT-CAGTTCCAGATT-GCCCTGCACCACTTGGCAGCP5CGACCAATGCGAGCTTGAGCTTTTTGCAG-GATATTCAG-GAAGTGCAAGGCTATGTGCTP6AGCGCTGTAACGGCACCTGACGCACTT-GATTGTGTGCA-ATCAGCACATAGCCTTGCACP7TGCCGTTACAGCGCTTGCGTATTGTGCGT-GGCACCCAG-CTGTTTGAAGATAACTATGCP8ATTATTCAGCGGATCGCCATTATCCAG-CACCGCCAGCG-CATAGTTATCTTCAAACAGCP9GGCGATCCGCTGAATAATACCACCCCTGT-GACCGGCG-CTAGTCCAGGCGGCCTGCGTGP10AAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGT-CAGGCTACG-CAGTTGCAGTTCACGCAGGCCGCC

Table2 Primer sequences of mutated HER2 designed by DNAWORK software

PrimerSequences(5'?3')P1'ATCATGACCCAGGTGTGCTAGGGCP3'TCACCGGAAACCCATCTGGATATGCTGCGTTAGCTGTA-TCAGGGCTGCCAAGTGGTGCP7'TGCCGTTACAGCGCTTGCGTTAGGTGCGTGGCAC-CCAG-CTGTTTGAAGATAACTATGC

對(duì)突變體HER2基因進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增條件同“2.1”項(xiàng)。所得到的DNA序列即為突變體pNO2Phe5HER2、pNO2Phe26HER2和pNO2Phe79HER2的DNA序列。

2.3 Wt HER2表達(dá)菌株的構(gòu)建

選擇限制性內(nèi)切酶BspH I和Hind III對(duì)PCR產(chǎn)物Ⅱ進(jìn)行雙酶切，選擇限制性內(nèi)切酶NcoI和Hind III對(duì)表達(dá)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含卡那霉素(Kan)抗性的LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取陽(yáng)性單克隆，接種在含Kan抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。測(cè)序。

2.4 HER2突變體表達(dá)菌株的構(gòu)建

同“2.3”項(xiàng)對(duì)突變體進(jìn)行構(gòu)建。將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET28a-5TAG-HER2,pET28a-26TAG-HER2和pET28a-79TAG-HER2質(zhì)粒分別與識(shí)別pNO2Phe的tRNA和氨酰tRNA合成酶的質(zhì)粒pAC-4tRNA-pNO2PheRS共轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含Kan和氯霉素(Cm)抗性的LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取陽(yáng)性單克隆，接種在含Kan和Cm抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。測(cè)序。

2.5 Wt HER2的表達(dá)純化

將測(cè)序正確的Wt HER2菌200 μL接種于含Kan抗性的LB培養(yǎng)基20 mL中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。按照1∶100的體積比將過(guò)夜菌加入到含Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃,220 r/min進(jìn)行培養(yǎng)3 h后(A600=0.6)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)5 h后，8 000 r/min離心5 min，收集菌體。超聲破碎菌體，離心取沉淀，對(duì)包涵體進(jìn)行清洗以去除雜蛋白和核酸等雜質(zhì)。用8 mol/L尿素對(duì)包涵體進(jìn)行變性，4 ℃過(guò)夜攪拌，變性液過(guò)Ni親和色譜柱，500 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，然后按體積比1∶4加入pH 9.0的復(fù)性緩沖液，用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液透析，超濾濃縮，BCA法測(cè)蛋白濃度。

2.6 突變體HER2的表達(dá)純化

將pNO2Phe5HER2、pNO2Phe26HER2和pNO2Phe79HER2菌200 μL分別接種于含Kan和Cm抗性的LB培養(yǎng)基20 mL中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。按照1∶100的體積比將過(guò)夜菌加入到含Kan和Cm抗性的液體M9培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min進(jìn)行培養(yǎng)7.5 h后，加入終濃度為0.1 mol/L的對(duì)硝基苯丙氨酸，培養(yǎng)0.5 h后，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)18 h后，8 000 r/min離心5 min，收集菌體。同“2.5”項(xiàng)對(duì)突變型HER2進(jìn)行純化。BCA法測(cè)蛋白濃度。

2.7 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗Wt HER2抗體滴度

將6～8周雌性C57BL/6小鼠分成PBS、Wt HER2、pNO2Phe5HER2、pNO2Phe26HER2、pNO2Phe79HER2組。皮下免疫小鼠，每次每只給藥20 μg，每周免疫1次，共免疫2周，最后一次免疫1周后，眼眶取血分離血清。ELISA法檢測(cè)小鼠抗血清中針對(duì)Wt HER2的抗血清滴度。在酶標(biāo)條中每孔加入終濃度為5 μg/mL的HER2蛋白100 μL，37 ℃孵育2 h；PBST清洗5次；然后每孔加入 5% BSA封閉液200 μL，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST清洗5次；每孔加入稀釋后的小鼠血清100 μL；37 ℃孵育2 h；PBST清洗6次；每孔加入稀釋后的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 100 μL，37 ℃孵育45 min；PBST清洗6次；每孔加入TMB底物反應(yīng)液100 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入2 mol/L的H2SO450 μL終止反應(yīng)；檢測(cè)A450處孔內(nèi)樣品的吸收度。

2.8 流式細(xì)胞法檢測(cè)小鼠抗血清識(shí)別SKBR-3能力

將6～8周雌性C57BL/6小鼠分成PBS、Wt HER2、pNO2Phe79HER2組，免疫過(guò)程及取血同“2.7”項(xiàng)。取稀釋后的血清200 μL與1×106個(gè)SKBR-3細(xì)胞混合，4 ℃孵育2 h。設(shè)置空白對(duì)照組：不含抗血清的PBS與SKBR-3細(xì)胞孵育。PBS清洗3次。將稀釋后的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG與清洗后的SKBR-3細(xì)胞進(jìn)行孵育，4 ℃孵育1 h。PBS清洗3次。用PBS緩沖液200 μL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度。

2.9 乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)小鼠抗血清介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)

小鼠分組、免疫同“2.8”項(xiàng)。最后一次免疫1周后，處死小鼠，利用小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，HER2+B16F10作為靶細(xì)胞。

固定靶細(xì)胞每孔5×103個(gè)，按照不同的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比(E∶T=50∶1、25∶1、12.5∶1)加入淋巴細(xì)胞，并在每孔加入小鼠血清4 μL。并設(shè)置空白組：淋巴細(xì)胞+小鼠抗血清，對(duì)照組：淋巴細(xì)胞+HER2+B16F10細(xì)胞。所有樣品孔內(nèi)都是200 μL體系。將樣品置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后。按照乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)乳酸脫氫酶的釋放，比較不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例下靶細(xì)胞裂解程度。

將靶細(xì)胞固定每孔5×103個(gè)，固定效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比(E∶T=50∶1)，加入效應(yīng)細(xì)胞，小鼠血清抗體稀釋50、200、800倍。并設(shè)置空白組：淋巴細(xì)胞+小鼠抗血清，對(duì)照組：淋巴細(xì)胞+HER2+B16F10細(xì)胞。所有樣品孔內(nèi)都是200 μL體系。將樣品置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后。按照乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)乳酸脫氫酶的釋放，比較不同抗體稀釋度下靶細(xì)胞裂解程度。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Student′st-test進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性比較，P<0.05為顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 Wt HER2及突變體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank(登錄號(hào):M11730.1)獲得目的基因片段Wt HER2，同時(shí)在第5、26、79位分別突變成TAG獲得pET28a-5TAG-HER2,pET28a-26TAG-HER2和pET28a-79TAG-HER2，利用在線網(wǎng)站DNAWORK設(shè)計(jì)10條長(zhǎng)引物，兩輪overlapping PCR后結(jié)果如圖1所示。在403 bp出現(xiàn)與理論大小相當(dāng)?shù)哪康幕颉?/p>

Figure1 Agarose electrophoresis analysis of overlapping PCR products

M:Marker;1:Wt HER2;2:pNO2Phe5HER2;3:pNO2Phe26HER2;4：pNO2Phe79HER2

3.2 Wt HER2及突變體的表達(dá)

對(duì)Wt HER2菌株進(jìn)行表達(dá)，取IPTG誘導(dǎo)前后全菌進(jìn)行電泳，如圖2-A所示。相比于誘導(dǎo)前的菌體，IPTG誘導(dǎo)后在14 .7 kD附近出現(xiàn)了條帶，與目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小相符。對(duì)突變體HER2菌株進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2-B～D所示。未加IPTG而加pNO2Phe時(shí)在14.7 kD處沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)，加IPTG而未加pNO2Phe時(shí)在14.7 kD處也沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)，而同時(shí)加入IPTG和pNO2Phe時(shí)在14.7 kD處有明顯目的蛋白的表達(dá)，證明非天然氨基酸成功定點(diǎn)引入到突變位點(diǎn)。

3.3 Wt HER2及突變體的純化

對(duì)Wt HER2及突變體進(jìn)行純化，將最終目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3。通過(guò)Gel-pro analyzer軟件分析，本研究得到了電泳純大于95%的Wt HER2及突變體蛋白，并通過(guò)MOLDI-TOF檢測(cè)pNO2Phe所在肽段的相對(duì)分子質(zhì)量(圖略)，結(jié)果如表3所示。檢測(cè)的結(jié)果與理論相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果一致，證明pNO2Phe的成功定點(diǎn)引入到Wt HER2。

Figure2 SDS-PAGE analysis of the expression Wt HER2 and mutated HER2

A:Wt HER2.M:Marker,1:Before IPTG induction,2:After IPTG induction;B-D:mutated HER2.M:Marker,1:Before IPTG induction and after pNO2Phe addition,2:After IPTG induction and before pNO2Phe addition,3:After IPTG induction and pNO2Phe addition

Figure3 SDS-PAGE analysis of the purified Wt HER2 and mutated HER2

M:Marker;1:Wt HER2;2:pNO2Phe5HER2;3:pNO2Phe26HER2;4:pNO2Phe79HER2

3.4 Wt HER2突變體的免疫原性

將PBS、Wt HER2、pNO2Phe5HER2、pNO2Phe26HER2、pNO2Phe79HER2免疫小鼠，第3周免疫效果如圖4所示。小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了能夠識(shí)別Wt HER2的抗體。與Wt HER2免疫組相比，pNO2Phe79HER2組產(chǎn)生了最高的抗Wt HER2片段的抗體滴度，且在血清稀釋100倍和1 000倍的情況下，pNO2Phe79HER2組與Wt HER2組都存在顯著性差異(P<0.001)。但pNO2Phe5HER2組和pNO2Phe26HER2組與Wt HER2組相比差異不顯著。上述結(jié)果提示，在C57BL/6小鼠體內(nèi)，pNO2Phe79HER2具有較強(qiáng)的免疫原性，后續(xù)選擇pNO2Phe79HER2做進(jìn)一步研究。

***P<0.001vsWt HER2 group

Table3 MALDI-TOF analysis of the peptides containing mutation sites from the mutated proteins digested by trypsin

ProteinPeptideMr (observed)Mr (calculated)pNO2Phe5HER2TQVCpNO2PheGTDMK1 174.611 174.46pNO2Phe26HER2MLRpNO2PheLYQGCQVVQGNLE2 042.952 042.92pNO2Phe79HER2pNO2PheVR466.26466.19

3.5 pNO2Phe79HER2免疫小鼠的抗體特異性

為了探究pNO2Phe79HER2免疫小鼠產(chǎn)生的抗體是否能夠與HER2過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pNO2Phe79HER2免疫抗血清能否識(shí)別HER2高表達(dá)的SKBR-3細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示。pNO2Phe79HER2組細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度與Wt HER2抗原片段組相比存在顯著性差異(P<0.001)，證明pNO2Phe79HER2突變體免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清能有效識(shí)別細(xì)胞膜上完整HER2受體。

A:Visual comparison of flow cytometry results.Sample 1:Antisera from mice immunized with pNO2Phe79HER2,Sample 2:Antisera from mice immunized with PBS,Sample 3:Antisera from mice immunized with Wt HER2,Sample 4:PBS;B:Statistics of mean fluorescence intensity (MFI)

***P<0.001vsPBS group;###P<0.001vsWt HER2 group

3.6 pNO2Phe79HER2免疫小鼠的藥效分析

為了檢測(cè)pNO2Phe79HER2腫瘤疫苗免疫小鼠血清能否通過(guò)ADCC效應(yīng)裂解HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的HER2高表達(dá)細(xì)胞株HER2+B16F10為靶細(xì)胞，以小鼠淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)乳酸脫氫酶的釋放判斷靶細(xì)胞的裂解程度。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)固定血清稀釋濃度為50∶1時(shí)，隨著效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例的降低，裂解腫瘤細(xì)胞能力下降。但與未加血清相比，pNO2Phe79HER2免疫的小鼠血清能夠顯著增加腫瘤細(xì)胞的裂解能力。當(dāng)固定E∶T=50∶1，隨著血清稀釋濃度的降低，裂解腫瘤細(xì)胞能力下降，但與Wt HER2組相比，pNO2Phe79HER2組能夠產(chǎn)生具有顯著性差異的靶細(xì)胞裂解率。

***P<0.001vsNo serum group;###P<0.001vsWt HER2 group

4 討 論

對(duì)硝基苯丙氨酸是一種免疫原性氨基酸，能有效打破自身蛋白免疫耐受，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體。但有研究顯示免疫原性氨基酸的引入受到位點(diǎn)限制[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了暴露在蛋白表面且不影響蛋白結(jié)構(gòu)的3個(gè)氨基酸作為突變位點(diǎn)。突變位點(diǎn)選擇的依據(jù)：(1)突變位點(diǎn)應(yīng)盡量暴露在抗原分子表面，這樣有利于非天然氨基酸的充分暴露，且不影響蛋白空間構(gòu)象；(2)具有明顯毒性的抗原分子，所選突變位點(diǎn)應(yīng)為其活性相關(guān)位點(diǎn)，突變后使其失活并僅具有免疫原性，這樣可避免疫苗在免疫過(guò)程中對(duì)機(jī)體造成傷害。通過(guò)遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)在HER2胞外區(qū)第5、26、79位定點(diǎn)引入非天然氨基酸，通過(guò)對(duì)包涵體蛋白的純化，本研究成功獲得了純度大于95%的Wt HER2抗原片段及其突變體。利用MOLDI-TOF檢測(cè)突變體胰酶酶解后pNO2Phe所在的肽段相對(duì)分子質(zhì)量，證明了本研究將pNO2Phe成功定點(diǎn)引入至突變位點(diǎn)。接著本研究通過(guò)檢測(cè)C57BL/6小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度判斷Wt HER2及突變體的免疫原性，結(jié)果表明pNO2Phe79HER2能針對(duì)Wt HER2產(chǎn)生最高滴度的抗體。因此本研究選擇產(chǎn)生抗體滴度最高的pNO2Phe79HER2做進(jìn)一步研究。有研究報(bào)道顯示，將HER2胞外區(qū)1～146位氨基酸片段用膽固醇普魯蘭多糖包裹形成CHP-HER2疫苗，然而形成的CHP-HER2蛋白疫苗雖然能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HER2胞外1～146位氨基酸片段抗體，但是產(chǎn)生的抗體不能有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞膜上的HER2受體[16]。本實(shí)驗(yàn)選用23～146位氨基酸殘基作為原型抗原(1～22位氨基酸殘基為信號(hào)肽)。結(jié)果顯示，與CHP-HER2相比，pNO2Phe79HER2免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清能夠與腫瘤細(xì)胞膜上具有天然構(gòu)象的HER2受體結(jié)合。在抗血清介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)固定E∶T為50∶1時(shí)，HER2+B16F10細(xì)胞裂解比例隨著小鼠血清濃度的稀釋而下降，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[17]。當(dāng)固定血清稀釋度為50∶1時(shí)，HER2+B16F10細(xì)胞裂解比例隨著淋巴細(xì)胞減少而下降。

綜上所述，本文通過(guò)遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)獲得的pNO2Phe79HER2可以有效打破免疫耐受，產(chǎn)生能夠識(shí)別SKBR-3細(xì)胞膜上天然構(gòu)象的HER2受體，并通過(guò)ADCC效應(yīng)裂解HER2高表達(dá)的細(xì)胞。因此，定點(diǎn)引入了pNO2Phe的pNO2Phe79HER2可以作為治療HER2過(guò)表達(dá)腫瘤的候選分子。

參 考 文 獻(xiàn)

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