張 麗， 張仙紅， 張建剛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801)

甘藍夜蛾[Mamestrabrassicae(L.)]別稱甘藍夜盜蛾、地蠶、菜夜蛾等，屬鱗翅目夜蛾科，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要害蟲之一，此蟲食性雜、寄主范圍廣，在國內(nèi)各蔬菜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和危害。甘藍夜蛾具有突發(fā)成災(zāi)、危害嚴重、抗藥性強、防治困難等特點[1]，嚴重危害蔬菜作物。在我國多地曾出現(xiàn)過大面積的大白菜受甘藍夜蛾危害，幾天內(nèi)造成絕收的現(xiàn)象[2]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。

昆蟲消化酶是由昆蟲中腸上皮細胞形成和分泌的，其活性直接影響昆蟲對食物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收。對消化系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)的破壞或?qū)ο赶档母蓴_必將導(dǎo)致昆蟲生長發(fā)育受阻乃至死亡。昆蟲消化酶活性的高低直接反映了昆蟲對營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用的能力。淀粉酶和蛋白酶是昆蟲體內(nèi)能量合成及消化必需重要的2種酶[3-4]。

在殺蟲劑市場，擬除蟲菊酯類殺蟲劑使用量排在第2位，其在我國的施用面積占殺蟲劑總施用面積的1/3以上。高效氯氰菊酯是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的代表，它的生物活性較高，具有觸殺和胃毒作用，由于其具有高效、廣譜、低毒和低殘留等特點，成為一種應(yīng)用廣泛的新型農(nóng)藥。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對光和熱較穩(wěn)定[5]，半衰期較長，因此在自然條件下很難快速降解，如任由其在環(huán)境中滯留，會造成嚴重的農(nóng)藥殘留問題。若使用不當(dāng)將成為環(huán)境污染物，因此擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在環(huán)境中的殘留備受人們關(guān)注。因此，以甘藍夜蛾不同齡期的幼蟲為試材，用不同濃度的高效氯氰菊酯進行飼喂，測定飼喂 3～24 h 后幼蟲中腸消化酶比活力，進行高效氯氰菊酯殺蟲劑對甘藍夜蛾幼蟲消化酶影響的研究，并對農(nóng)藥的使用劑量提供指導(dǎo)性的建議，旨在為高效氯氰菊酯的合理使用、降低殘留提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

甘藍夜蛾卵塊，采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)未施農(nóng)藥的園藝菜地，在室內(nèi)用園藝菜地的甘藍飼養(yǎng)至4、5、6齡期備用。

1.2 供試試劑

4.5%高效氯氰菊酯乳油，由北京中保綠農(nóng)科技集團有限公司提供。

1.3 試蟲處理

試驗取4.5%高效氯氰菊酯乳油稀釋1 500、2 000、2 500 倍3個濃度，并以清水為空白對照組。將菜葉切成 10～15 cm 2小塊于不同濃度的藥液中浸漬30 s，取出并別上曲別針懸掛晾干，置于直徑為15 cm培養(yǎng)皿中。取蛻皮后 1 d 4、5、6齡的幼蟲饑餓6 h后，移入裝有不同濃度農(nóng)藥的培養(yǎng)皿中。觀察記錄處理3、6、9、12、24 h的中毒情況。每組6頭幼蟲，重復(fù)3次。對照組死亡率小于10%的試驗為有效試驗。

1.4 酶液的制備

取樣后，立即在冰盤上迅速解剖幼蟲，然后加入冰冷(0.0～0.5 ℃)的0.15 mol/L生理鹽水沖洗，截取試蟲中腸，并于 -70 ℃ 冷凍冰箱冰凍保存。測試前，將中腸組織用濾紙吸掉表面水分后，按鮮質(zhì)量1 g ∶20 mL加0.2 mol/L pH值為6.9的磷酸鹽緩沖液，在冰浴中勻漿，勻漿液在4 ℃、4 000 r/min 下離心20 min，取上清液作為酶原。

1.5 蛋白酶活性測定

參照北京大學(xué)生物系生物化學(xué)教研室的方法[6]對蛋白酶活性進行測定。取20 μL酶液加入50 μL 0.5%酪蛋白，混勻后于37 ℃水浴15 min，然后加入50 μL 10%三氯乙酸，混勻后在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min，取50 μL上清液移入離心管中，加入250 μL 0.55 mol/L碳酸鈉溶液，25 μL福林-酚試劑，在37 ℃條件下水浴15 min。最后在波長為 680 nm 處測定吸光度D680 nm。

1.6 淀粉酶活性的測定

參照李志剛等的方法[7]對淀粉酶的活性進行測定。以 50 μL 2%淀粉為底物，加入200 μL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH值=5.8)，20 μL酶液與之反應(yīng)。室溫下反應(yīng)10 min后，將其置于37 ℃條件下水浴60 min，加250 μL 3，5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，然后沸水浴5 min，于波長550 nm處測定吸光度D550 nm。無酶反應(yīng)體系用20 μL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH值=5.8)代替酶液，作為對照。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 15.0軟件進行方差分析，并采用Duncan’s新復(fù)極差法進行平均數(shù)的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效氯氰菊酯對甘藍夜蛾幼蟲蛋白酶活性的影響

由圖1可以看出，甘藍夜蛾4齡幼蟲取食不同濃度高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片后，其體內(nèi)中腸蛋白酶比活力隨著時間的推移逐漸降低，且高效氯氰菊酯濃度越高，中腸蛋白酶比整體越低。當(dāng)甘藍夜蛾4齡幼蟲取食稀釋2 500、2 000、1 500 倍的4.5%高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片3 h后，其蛋白酶比活力分別為對照的0.93、0.84、0.75倍；各處理經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差(Duncan’s multiple range test，簡稱DMRT)法統(tǒng)計分析，2 500倍濃度處理與對照差異不顯著，另外2個濃度處理與對照差異顯著；當(dāng)取食6 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.47、0.47、0.29倍；當(dāng)取食 9 h 后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.31、0.27、0.23倍；當(dāng)取食12 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.22、0.19、0.05倍；當(dāng)取食24 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.05、0.05、0.01倍；取食6、9、12、24 h 后各濃度處理的蛋白酶比活力與對照均表現(xiàn)顯著差異。不同濃度的高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾幼蟲后，其體內(nèi)蛋白酶比活力整體隨著高效氯氰菊酯濃度的增加整體呈下降趨勢，其中處理24 h后下降得更為明顯，且顯著低于對照，可見隨著高效氯氰菊酯濃度的提高，對甘藍夜蛾幼蟲蛋白酶比活力的影響程度顯著增加。

由圖2可以看出，甘藍夜蛾5齡幼蟲取食不同濃度高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片后，其體內(nèi)中腸蛋白酶比活力隨著時間的推移逐漸降低，且高效氯氰菊酯濃度越高，中腸蛋白酶比活力(除9 h外)越低。當(dāng)甘藍夜蛾5齡幼蟲取食稀釋 2 500、2 000、1 500倍的4.5%高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片 3 h 后，其蛋白酶比活力分別為對照的0.97、0.93、0.73倍，其中稀釋2 500倍濃度處理與對照差異不顯著，另外2個濃度處理均與對照差異顯著。當(dāng)取食6 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.91、0.82、0.43倍；當(dāng)取食9 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.58、0.65、0.28倍；當(dāng)取食12 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.36、0.32、0.04倍；當(dāng)取食24 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.14、0.12、0.000 7倍；各處理經(jīng)DMRT法統(tǒng)計分析，取食6、9、12、24 h后各濃度處理的蛋白酶比活力與對照均表現(xiàn)顯著差異。不同濃度的高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾幼蟲后，其體內(nèi)蛋白酶比活力同4齡呈相似的變化趨勢，即隨著高效氯氰菊酯濃度的增加，其蛋白酶比活力整體呈下降趨勢，其中處理24 h后下降得更為明顯，且各處理顯著低于對照，可見隨著高效氯氰菊酯濃度的提高，對甘藍夜蛾幼蟲蛋白酶比活力的影響程度整體顯著增加，但整個下降趨勢沒有4齡幼蟲時明顯。

由圖3可以看出，甘藍夜蛾6齡幼蟲取食不同濃度高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片后，其體內(nèi)中腸蛋白酶比活力隨著時間的推移逐漸降低，且高效氯氰菊酯濃度越高，中腸蛋白酶比活力越低。當(dāng)甘藍夜蛾6齡幼蟲取食稀釋2 500、2 000、1 500 倍的4.5%高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片3 h后，其蛋白酶比活力分別為對照的0.90、0.89、0.70倍，其中稀釋 2 500倍、2 000倍濃度處理與對照差異不顯著，稀釋 1 500 倍濃度處理與對照差異顯著。當(dāng)取食6 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.86、0.41、0.33倍，稀釋2 500倍濃度處理與對照差異不顯著，稀釋2 000倍、1 500倍濃度處理與對照差異顯著；當(dāng)取食9 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.64、0.69、0.28倍；當(dāng)取食12 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.23、0.20、0.19倍；當(dāng)取食24 h后，各處理蛋白酶比活力分別為對照的0.18、0.17、0.05倍。取食9、12、24 h 后各濃度處理的蛋白酶比活力與對照均表現(xiàn)顯著差異。不同濃度的高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾幼蟲后，其體內(nèi)蛋白酶比活力同4、5齡有相似的變化趨勢，即隨著高效氯氰菊酯濃度的增加蛋白酶比活力整體呈下降趨勢，其中處理24 h后下降得更為明顯，且各濃度處理顯著低于對照，可見隨著高效氯氰菊酯濃度的提高，對甘藍夜蛾幼蟲蛋白酶比活力影響程度整體顯著增加，但整個下降趨勢沒有4、5齡幼蟲時明顯。

2.2 高效氯氰菊酯對甘藍夜蛾幼蟲淀粉酶活性的影響

由圖4可以看出，甘藍夜蛾4齡幼蟲取食不同濃度高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片后，其體內(nèi)中腸淀粉酶比活力隨著時間的推移逐漸降低，且高效氯氰菊酯濃度越高，中腸淀粉酶活力越低。當(dāng)甘藍夜蛾4齡幼蟲取食稀釋2 500、2 000、1 500倍的4.5%高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片3 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.73、0.68、0.46倍；當(dāng)取食6h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.66、0.62、0.39倍；當(dāng)取食9 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.48、0.45、0.29倍；當(dāng)取食12 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.37、0.34、0.22倍；當(dāng)取食24 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.17、0.16、0.04倍。取食3、6、9、12、24 h后各濃度處理的淀粉酶比活力與對照均表現(xiàn)為顯著差異。不同濃度高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾幼蟲后，其體內(nèi)淀粉酶比活力隨著高效氯氰菊酯的濃度的增加明顯下降，可見隨著高效氯氰菊酯濃度的提高，對甘藍夜蛾幼蟲淀粉酶活性影響程度明顯增加。

與同齡期蛋白酶比活力相比，隨著高效氯氰菊酯濃度的增加，對甘藍夜蛾幼蟲中腸淀粉酶的影響更加明顯，在取食 3 h 時各濃度處理即出現(xiàn)顯著差異。

由圖5可以看出，甘藍夜蛾5齡幼蟲取食不同濃度高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片后，其體內(nèi)中腸淀粉酶活力隨著時間的推移逐漸降低，且高效氯氰菊酯濃度越高，中腸淀粉酶比活力整體越低。當(dāng)甘藍夜蛾5齡幼蟲取食稀釋2 500、2 000、1 500倍的4.5%高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片3 h后，其淀粉酶比活力分別為對照的0.87、0.85、0.85倍；當(dāng)取食6 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.83、0.82、0.82倍；當(dāng)取食9 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.73、0.73、0.75倍；當(dāng)取食12 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.63、0.55、0.51倍；當(dāng)取食24 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.49、0.20、0.13倍。取食3、6、9、12、24 h后各濃度處理的淀粉酶比活力與對照均表現(xiàn)顯著差異。不同濃度的高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾幼蟲后，其體內(nèi)淀粉酶比活力同4齡有相似的變化趨勢，即隨著高效氯氰菊酯濃度的增加淀粉酶比活力整體呈下降趨勢，可見隨著高效氯氰菊酯濃度的提高，對甘藍夜蛾幼蟲淀粉酶活力影響程度整體明顯增加。但與4齡時相比，沒有其下降趨勢明顯。

由圖6可以看出，甘藍夜蛾6齡幼蟲取食不同濃度高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片后，其體內(nèi)中腸淀粉酶比活力隨著時間的推移逐漸降低，且高效氯氰菊酯濃度越高，中腸淀粉酶比活力越低。當(dāng)甘藍夜蛾6齡幼蟲取食稀釋2 500、2 000、1 500 倍的4.5%高效氯氰菊酯處理的甘藍葉片3 h后，其淀粉酶比活力分別為對照的1.17、1.11、0.98倍，此時，稀釋 2 500 倍、2 000倍濃度處理后淀粉酶比活力與對照相比偏高，且差異顯著。當(dāng)取食6 h后，其淀粉酶比活力分別為對照的1.04、0.98、0.74倍，稀釋2 500倍濃度處理后淀粉酶比活力依然與對照相比偏高，且與對照差異顯著，而稀釋2 000倍、1 500 倍濃度處理后的淀粉酶比活力比對照低，且與對照差異顯著；當(dāng)藥物隨著時間不斷滲透，取食9 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.75、0.72、0.66倍；當(dāng)取食12 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.61、0.43、0.33倍；當(dāng)取食24 h后，各處理淀粉酶比活力分別為對照的0.41、0.17、0.06倍。取食9、12、24 h 后各濃度處理的淀粉酶比活力與對照均表現(xiàn)顯著差異。高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾6齡幼蟲，除稀釋1 500倍濃度處理低于對照外，起始階段(3 h)淀粉酶比活力與對照相比有所增強，但隨著藥物的不斷滲透淀粉酶比活力逐漸降低，當(dāng)處理 9 h 后，淀粉酶比活力要低于對照，并且下降幅度隨著高效氯氰菊酯濃度的增加而增加。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，甘藍夜蛾幼蟲經(jīng)高效氯氰菊酯處理后，淀粉酶和蛋白酶2種消化酶比活力有不同的影響，除了6齡幼蟲在3、6 h時的淀粉酶比活力有高于對照的現(xiàn)象外，其他消化酶比活力均低于對照，其影響程度隨著劑量的增加整體呈增大趨勢，并且隨著齡期的增大影響程度在逐漸弱化。這樣就勢必影響昆蟲對食物的消化和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，減少了昆蟲的取食量，從而干擾昆蟲正常的生長和發(fā)育，抗逆性降低。所以在用藥時齡期越小越容易控制。對甘藍夜蛾施用高效氯氰菊酯時，應(yīng)盡量在4齡前使用，這樣在低劑量情況下不但可以完全控制種群數(shù)量，還可以減少藥劑殘留。

淀粉酶是昆蟲消化系統(tǒng)中重要的消化酶，該酶可將昆蟲體內(nèi)的淀粉、糖原等水解成為可溶性麥芽糖、葡萄糖，參與體內(nèi)的能量代謝[8]。抑制昆蟲淀粉酶的活性，能夠降低昆蟲體內(nèi)糖類的同化作用，從而抑制昆蟲的生長發(fā)育[9]；抑制昆蟲體內(nèi)淀粉酶的活性可以降低其體內(nèi)綜合生理功能的效率，同樣影響其自身的生長發(fā)育[10-11]。本研究結(jié)果表明，高效氯氰菊酯處理甘藍夜蛾6齡幼蟲時，當(dāng)處理3、6 h后，稀釋2 500倍濃度處理的甘藍夜蛾幼蟲中腸淀粉酶比活力分別為對照的1.17、1.04倍，與對照相比偏高，且差異顯著。但隨著藥物的不斷滲透淀粉酶比活力逐漸降低；當(dāng)處理9 h后，淀粉酶比活力低于對照。經(jīng)分析可能是因為藥物進入腸腔后，刺激腸壁細胞超量分泌消化酶來與藥物結(jié)合或降解它，以緩和或消除其毒害作用，這樣就使蟲體消耗了大量用于合成消化酶的氨基酸和能量，導(dǎo)致體能衰竭。但隨著藥物不斷滲透，甘藍夜蛾幼蟲取食量減少、酶底物的量不足，造成酶比活力逐漸下降。與莫建初等報道的結(jié)果[12-13]相似。

本試驗中高效氯氰菊酯對甘藍夜蛾幼蟲中腸消化酶活性有一定的抑制作用，且對蛋白酶活性的抑制作用比其他消化酶更明顯，研究結(jié)果與駱穎等所研究的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾消化酶活性的影響結(jié)論[14]類似。蛋白酶比活力下降較多可能是因為試蟲本身處于饑餓狀態(tài)，雖然人們把原因歸結(jié)為營養(yǎng)不足，但不能排除農(nóng)藥對酶結(jié)構(gòu)的影響。近年來大量研究表明，抑制腸道蛋白酶的活性可降低許多鱗翅目昆蟲腸道綜合生理功能的效率[15]。昆蟲取食了含蛋白酶抑制劑的食料后，由于消化功能受阻，表現(xiàn)為生長發(fā)育不良[16]。對昆蟲中腸消化酶活性的抑制，使食物的營養(yǎng)轉(zhuǎn)換不足，影響昆蟲的生活力。

參考文獻：

[1]吳 曉，付曉偉，趙新成，等. 甘藍夜蛾MamestrabrassicaeL. 飛行能力研究[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2016，53(3)：595-603.

[2]張振海，楊振平，孟新房，等. 2.4%多殺霉素·高氯氟水乳劑防治甘藍甜菜夜蛾田間藥效試驗[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，57(2)：45-47.

[3]Tatun N，Singtripop T，Tungjitwitayakul J，et al. Regulation of soluble and membrane -bound trehalaseactivity and gene expression of the enzyme in the larval midgut of the bamboo borerOmphisafuscidentalis[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38(8)：788-795.

[4]Wegener G，Tschiedel V，Schl?der P，et al. The toxic and lethal effects of the trehalase inhibitor trehazolin in locusts are caused by hypoglycaemia[J]. Journal of experimental Biology，2003，206(7)：1233-1240.

[5]郭勇飛，尹明明，陳福良. 乳化劑對4.5%高效氯氰菊酯水乳劑物理穩(wěn)定性的影響[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2011，13(1)：71-78.

[6]北京大學(xué)生物系生物化學(xué)教研室. 生物化學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，1987.

[7]李志剛，韓詩疇，郭明昉，等. 取食不同食料植物對安婀珍蝶的營養(yǎng)利用及中腸四種酶活力的影響[J]. 昆蟲學(xué)報，2005，48(5)：674-678.

[8]李藝瓊，姚羽芯，彭正強，等. 不同生長階段椰樹葉片對椰心葉甲中腸消化酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(7)：94-97.

[9]Ishimoto M，Yamada T，Kaga A. Insecticidal activity of anα-amylase inhibitor-like protein resembling a putative precursor ofα-amylase inhibitor in the common beanPhaseolusvulgarisL.[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1999，1432(1)：104-112.

[10]Slansky F J，Scriber J M. Food consumption and utilization[M]//Comprehensive insect physiology，biochemistry and pharmacology. Oxford：Pergamon Press，1985：87.

[11]Timmins W A，Reynolds S E. Azadirachtin inhibits secretion of trypsin in midgut ofManducasextacaterpillars：reduced growth due to impaired protein digestion[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，1992，63(1)：47-54.

[12]莫建初，張 軍，王問學(xué). 芫花粗提物對鱗翅目幼蟲消化酶和解毒酶的影響[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報，2001，21(1)：5-9.

[13]譚世強，張愛華，許永華，等. 人參總皂苷對黏蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量及消化酶活性的影響[J]. 中國中藥雜志，2013，38(11)：1692-1696.

[14]駱 穎，張茂新，凌 冰. 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾消化酶活性的影響[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報，2012，34(3)：289-294.

[15]Terra W R，F(xiàn)erreira C. Insect digestive enzymes：properties，compartmentalization and function[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Comparative Biochemistry，1994，109(1)：1-62.

[16]王琛柱. 害蟲防治中植物蛋白酶抑制劑的研究[J]. 世界農(nóng)業(yè)，1992(12)：28-29.