寧秋燕，范 凱，王 敏，石元值，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京100081)

茶樹根系XTHs和伸展蛋白對不同濃度鋁的響應(yīng)

寧秋燕1，2，范 凱1，王 敏1，2，石元值1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京100081)

摘 要：為探索鋁對茶樹根系生長的影響，以一年生安吉白茶扦插苗為研究材料，比較不同鋁濃度處理28d后茶樹根系生長的表型差異、生長參數(shù)，以及細(xì)胞壁相關(guān)蛋白XTHs[木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶(XET)/水解酶(XEH)]和伸展蛋白(Expansins)的響應(yīng)。結(jié)果表明，與無鋁對照相比，加鋁處理的茶樹根系在表型、生長參數(shù)上均表現(xiàn)出了促進(jìn)生長的現(xiàn)象，尤其是0.4、1.0mmol·L-1的鋁處理下與對照差異顯著(P<0.05)，根系總長分別增加了206%和209%、根尖數(shù)分別增加了175%和166%、根系表面積分別增加了227%和286%、根系體積分別增加了246%和385%。相應(yīng)地，茶樹根系中CsEXPB14、CsEXLA8基因表達(dá)量在0.4mmol·L-1鋁處理下顯著(P<0.05)高于對照與4.0mmol·L-1鋁處理組。Expansins活性也在0.4mmol·L-1鋁濃度下最高，較不加鋁處理提高了84.3%。CsXTH14基因表達(dá)量在0.4、1.0mmol·L-1鋁濃度下較對照顯著(P<0.05)上調(diào)，XET酶活性亦表現(xiàn)出隨鋁濃度升高而增加的趨勢，直至4.0mmol·L-1的鋁濃度下才受到顯著抑制。XTHs和Expansins基因表達(dá)、XET和Expansins活性與根系生長呈正相關(guān)關(guān)系，表明一定濃度的鋁(≤1mmol·L-1)處理，可以通過誘導(dǎo)XTHs和Expansins基因表達(dá)上調(diào)，提高XET和Expansins活性，促進(jìn)茶樹根系的生長。

關(guān)鍵詞：環(huán)境脅迫；植物營養(yǎng)；飲料作物；基因表達(dá)；根系生長

鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素之一，約占地殼總質(zhì)量的7.5%，在土壤中含量比例可高達(dá)6.6%。鋁對植物及環(huán)境的影響與其化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)，固定態(tài)鋁毒性最小，離子態(tài)鋁毒性最大。通常鋁的化學(xué)形態(tài)取決于環(huán)境pH值，在pH值低于4.5的酸性土壤中，Al3+是鋁最常見的存在形態(tài)。有研究認(rèn)為，鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要障礙因子[1]。茶樹(Camelliasinensis)是一種典型的聚鋁植物，在鋁含量較高且活性較強(qiáng)的酸性土壤上可健康生長。大量研究表明，一定濃度的鋁能促進(jìn)茶樹根系生長[2-3]，課題組前期研究表明，當(dāng)鋁濃度為0.4～1.0mmol·L-1時，能顯著促進(jìn)茶樹不定根的生長[4]。為闡明鋁對茶樹根系生長的影響機(jī)制，研究人員從生理和分子水平展開了廣泛的研究，但大多數(shù)研究主要集中在茶樹如何緩解根系鋁毒害上[5-9]。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者近年來從代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上進(jìn)行了更加深入全面的研究[10-12]。

植物根系的伸長首先需要細(xì)胞壁的松弛和延展，其中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶XET/水解酶XEH(統(tǒng)稱XTHs)和伸展蛋白(Expansins)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。XTHs是一類以木葡聚糖作為底物來催化木葡聚糖分子轉(zhuǎn)移或水解的酶，可使木葡聚糖鏈之間的鍵斷裂和再形成，在細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和延展性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13-14]。伸展蛋白(Expansins)最初是在生長活躍的黃瓜幼苗中鑒定出來的，其功能是破壞纖維素微纖絲和交聯(lián)聚糖之間的氫鍵[15-16]，從而使細(xì)胞壁疏松，以促進(jìn)植物細(xì)胞生長。XTHs和Expansins均為多基因編碼的基因家族，在根系的生長中發(fā)揮重要作用。在各種維管植物中，靠近根毛起始點(diǎn)及根伸長區(qū)都有高的 XET活性，能夠疏松成熟的細(xì)胞，誘導(dǎo)根毛的發(fā)生[17]。對擬南芥相關(guān)突變體的研究表明，擬南芥根的伸長涉及AtXTH18表達(dá)[18]。大豆β-Expansin基因家族GmEXP1的特異性表達(dá)促進(jìn)了大豆根的生長[19]；玫瑰Expansin基因RhEXPA4的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因擬南芥株系側(cè)根增多[20]。在水稻中，OsEXPA17是根毛生長發(fā)育所必需的調(diào)控基因[21]，OsEXPA8根組織特異基因的過表達(dá)可增加水稻根系生長[22]，OsEXPB2參與了根毛的形成[23]。大量研究表明，鋁對植物根系XTHs和Expansins基因的表達(dá)有重要影響。Yang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，50μmol·L-1鋁處理顯著抑制了擬南芥根系XTH14、XTH15、XTH31基因表達(dá)，XET酶活性明顯下降，根系生長受到明顯抑制。擬南芥XTH31基因缺失突變體，增強(qiáng)了根系對鋁的抗性，鋁脅迫下根系生長沒有顯著變化[25]。Che等[26]在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，鋁處理誘導(dǎo)了水稻根系OsEXPA10的上調(diào)表達(dá)，敲除株系的根系生長受到顯著抑制。由此可見，XTHs和Expansins基因在根系響應(yīng)鋁脅迫中發(fā)揮了重要作用。對于耐鋁作物茶樹來說，在不同鋁濃度環(huán)境下，茶樹根系中Expansins和XTHs的響應(yīng)情況及對茶樹根系生長的影響尚少見報道。

本研究通過測定不同鋁濃度處理下茶樹根系XET酶和Expansins蛋白活性及其對應(yīng)編碼基因的表達(dá)水平，結(jié)合茶樹根系生長表型，探究茶樹根系中的XTHs和Expansins蛋白及相關(guān)基因?qū)︿X的響應(yīng)，為明確鋁對茶樹根系生長的促進(jìn)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

1.2 根系形態(tài)構(gòu)型測定

利用專業(yè)版的WinRHIZO2012根系分析軟件獲得根系掃描圖像，獲取根系總長、表面積、體積和根尖數(shù)，以及根系生長參數(shù)等參數(shù)。

1.3 茶樹根系XET提取及活性測定

4℃下將1g新鮮茶苗嫩側(cè)根剪切成小片段，放置到預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入3mL緩沖液B[200mmol·L-1琥珀酸鹽(Na+)，pH值5.5，添加3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)]，4℃研磨5min形成勻漿，用1mL緩沖液將勻漿混合液轉(zhuǎn)移至試管中，置于搖床中振蕩3h以提取酶，4℃離心(10500g，45min)，取上清液。添加1.569 g固體硫酸銨至3mL上清液中，充分溶解后得到80%飽和度的硫酸銨溶液，4℃靜置過夜，離心(10500g，45min)，棄去上清液，再次加入3mL 80%飽和度的硫酸銨溶液溶解沉淀，重復(fù)離心操作，再次棄去上清液，最后加入0.5mL 80%飽和度的硫酸銨溶解沉淀。取300μL硫酸銨蛋白質(zhì)懸浮液樣品，用微型離心機(jī)離心5min，棄去上清液。用400μL的25mmol·L-1吡啶緩沖液(用醋酸調(diào)pH至4.75)溶解沉淀，搖勻，-80℃保存待測。以3.5mL的1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))450kBq木葡聚糖溶液為底物，添加等體積的200mmol·L-1的含10mmol·L-1CaCl2的琥珀酸鈉鹽緩沖液(pH值5.5)，使[3H]XXXGol的含量為64kBq·mL-1。將底物分配至96孔板中，按每孔50μL，即3.2kBq·孔-1計(jì)。將待測蛋白酶在冰上解凍，搖動使蛋白重新形成懸浮液。每孔加入20μL的酶溶液并混勻(空白對照孔用蒸餾水替代)。每孔最終體積為70μL，包含有0.33%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(2.3kBq)木葡聚糖。反應(yīng)75min后取16μL的反應(yīng)混合液(0.52kBq)加載于4cm×4cm Whatman 3 MM紙片上，干燥后用流動的水沖洗，紙晾干后進(jìn)行3H分析，以計(jì)算XET酶活性。

1.4 茶樹根系Expansins的提取及活性測定

提取方法參照文獻(xiàn)[27]：取12株茶樹新根樣品10 g切段，用2mL的緩沖液A(15mmol·L-1磷酸鈉，pH值6.0)研磨勻漿，4℃離心(6000g，5min)，棄去上清液。沉淀再次用緩沖液A懸浮和離心，共重復(fù)4次，最終獲得的沉淀用0.3～0.5mL的緩沖液B[50mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，pH值7.0，1mol·L-1NaCl，2mmol·L-1EDTA，2mmol·L-1焦亞硫酸鈉]再懸浮，靜置至少1h后4℃離心(6000g，10min)，取上清液，用于Expansins活性檢測。

茶樹根系Expansins活性檢測采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒方法。分別設(shè)空白孔(不加樣品及酶標(biāo)試劑)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μL、再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后，置37℃溫育30min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。用封板膜封板后，置37℃溫育30min，洗滌后，每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10min后，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)進(jìn)行測定。測定用空白調(diào)0，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(D)。測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

1.5 茶樹根系總RNA提取及cDNA合成

茶樹根系總 RNA 提取方法參照天根公司提供的植物多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行，其中試劑盒中的SL裂解液換為CTAB裂解液，且樣品加入裂解液后65℃水浴30min。以RNA為模板，根據(jù)TaKaRa PrimeScriptTMRT Kit(with gDNase)提供的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為熒光定量模板。

1.6 茶樹根系XTH和Expansins基因熒光定量PCR分析

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得的XTH和Expansins基因序列片段，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物(表1)。以茶樹GAPDH為內(nèi)參基因，分析不同鋁濃度處理安吉白茶茶樹根系XTH和Expansins基因相對表達(dá)量。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 10μL，ROX DyeⅡ0.4μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各0.4μL，cDNA 2μL，加水至終體積20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5s，60℃退火延伸34s，40個循環(huán)。3次技術(shù)性重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，對各處理采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物

2.1 不同鋁濃度對茶樹根系生長的影響

不同鋁濃度下，茶苗根系的生長產(chǎn)生了明顯的表型差異(圖1)。與CK相比，加鋁處理下茶樹新根系的生長量與生長速率顯著(P<0.05)增加。無鋁條件下，茶樹根系生長勢較弱，新生根少，且生長速率慢，根系顏色整體呈褐色；加鋁后，茶樹根系生長旺盛，新根數(shù)量多，生長速率快，根系整體顏色呈嫩白色，生長勢強(qiáng)。但不同鋁濃度對茶樹根系生長的影響存在較大的差異，0.4、1.0mmol·L-1鋁處理下茶樹新根生長優(yōu)于4.0mmol·L-1鋁處理。表明一定濃度范圍內(nèi)的鋁離子可促進(jìn)茶樹根系生長，但過高的鋁濃度下，這種促進(jìn)作用可能會減弱。

根系掃描結(jié)果(圖2)進(jìn)一步說明了不同鋁濃度對茶樹根系生長的影響差異。與CK相比，0.4、1.0mmol·L-1鋁處理的茶樹根系總長分別增加了206%和209%，根尖數(shù)分別增加了175%和166%，差異顯著(P<0.05)，表明0.4mmol·L-1和1.0mmol·L-1鋁顯著促進(jìn)了茶樹根系的伸長和不定根的形成，而在4.0mmol·L-1鋁處理下，鋁對茶樹根系的伸長和不定根的形成無顯著影響。0.4mmol·L-1和1.0mmol·L-1鋁處理的茶樹根系表面積較CK分別增加了227%和286%、根系體積分別增加了246%和385%，差異顯著(P<0.05)，推測0.4mmol·L-1和1.0mmol·L-1鋁處理可能促進(jìn)了根細(xì)胞的膨大，使根系表面積和體積增加。但4mmol·L-1鋁處理的茶樹根表面積和根體積與對照無顯著差異。由此可見，0.4mmol·L-1和1.0mmol·L-1鋁處理促進(jìn)了茶樹不定根的形成和根系的生長，表現(xiàn)為茶樹根長、根尖數(shù)、根表面積及根體積的顯著增加，當(dāng)鋁濃度達(dá)到4.0mmol·L-1時，無顯著促進(jìn)作用。

2.2 不同鋁濃度對茶樹根系XET酶與Expansins活性的影響

如圖3所示：0.4mmol·L-1和1.0mmol·L-1鋁處理下，茶樹根系中的XET活性與對照無顯著差異，4.0mmol·L-1鋁處理下，茶樹根系的XET活性顯著(P<0.05)低于CK，說明4.0mmol·L-1鋁濃度處理對茶樹根系XET活性產(chǎn)生了顯著的抑制作用。不同濃度鋁處理茶樹28d，0.4mmol·L-1鋁處理的茶樹根系伸展蛋白的活性較CK顯著(P<0.05)增加。但1.0mmol·L-1和4.0mmol·L-1鋁處理下，茶樹根系伸展蛋白活性與CK無顯著差異。上述結(jié)果表明，一定濃度的鋁處理提高了茶樹根系XET和Expansins活性，使細(xì)胞壁松弛、細(xì)胞膨大，有助于根系伸長、分生與膨大，促進(jìn)茶樹根系生長。

A，E，0mmol·L-1 Al3+;B，F(xiàn)，0.4mmol·L-1 Al3+;C，G，1.0mmol·L-1 Al3+;D，H，4.0mmol·L-1 Al3+.圖1 鋁對安吉白茶茶苗根系生長的影響Fig.1 Effects of Al on root growth of tea plants

柱上無相同小寫字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05.The same as below.圖2 鋁對安吉白茶茶樹根系總長、根表面積、根尖數(shù)、根體積的影響Fig.2 Effects of Al on total root length，root superficial area，roots tips，root volume of tea plants

2.3 不同鋁濃度對茶樹根系XTHs和Expansins基因表達(dá)量的影響

圖3 不同鋁濃度處理對茶樹根系XET及Expansins活性的影響Fig.3 Effects of Al on XET and Expansins activities in root of tea plants

圖4 鋁對茶樹根系XTHs和 Expansins基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Al on XTHs and Expansins gene expression in root of tea plants

對不同鋁濃度處理后的茶樹根系轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)4條unigenes分別與獼猴桃基因XTH14、番茄基因XTH23、水稻基因EXPB14、水稻基因EXLA8序列高度同源(>70%)，將其分別命名為CsXTH14、CsXTH23、CsEXPB14、CsEXLA8，并對不同濃度鋁處理后的根系表達(dá)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析。圖4結(jié)果表明，0.4、1.0mmol·L-1鋁處理的茶樹根系中CsXTH23基因表達(dá)量與CK無顯著差異，而4.0mmol·L-1鋁處理的茶樹根系CsXTH23基因的表達(dá)量則顯著(P<0.05)低于CK，表明CsXTH23主要受高濃度鋁的抑制作用。不同鋁濃度處理28d后，與CK相比，0.4mmol·L-1鋁處理的茶樹根系CsXTH14基因表達(dá)量最高，但隨著鋁濃度進(jìn)一步增加，CsXTH14基因表達(dá)量呈現(xiàn)降低趨勢，但與CK無顯著差異。由此可見，一定濃度的鋁可以誘導(dǎo)CsXTH14基因表達(dá)，而高濃度鋁則會抑制CsXTH14的表達(dá)。兩個伸展蛋白基因的表達(dá)均表現(xiàn)為在0.4mmol·L-1鋁處理下最高。但隨鋁濃度升高，CsEXPB14表達(dá)量顯著(P<0.05)下調(diào)，而CsEXLA8表達(dá)量無顯著變化?？梢钥闯?，鋁可以誘導(dǎo)茶樹伸展蛋白基因表達(dá)，且CsEXPB14對鋁濃度的響應(yīng)更敏感。

2.4 不同鋁濃度茶樹根系XTHs和Expansins基因表達(dá)、XET酶和Expansins蛋白活性與根系生長的相關(guān)性

如表2所示，CsXTH23基因表達(dá)量與茶樹根系總長、根表面積、根體積、根尖數(shù)均無顯著相關(guān)性。CsXTH14基因的表達(dá)量與茶樹根系總長無顯著相關(guān)性，與根表面積呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與根體積、根尖數(shù)呈顯著(P<0.05)正相關(guān)。

表2不同鋁濃度下茶樹根系XTHs和Expansins基因表達(dá)量、XET酶和Expansins蛋白活性、根系生長的相關(guān)系數(shù)

Table2Correlation coefficients withinXTHsandExpansinsgene expression level，XET and Expansins activities and root growth under different Al concentrations in root of tea plants

指標(biāo)Index根長Root length根表面積Root surface area根體積Root volume根尖數(shù)Root tipsXET活性XET activityExpansins活性Expansins activityCsXTH230.3080.4260.2690.3850.719**CsXTH140.5310.737**0.609*0.689*0.359CsEXPB140.1820.3230.2840.2700.740**CsEXLA80.685*0.735**0.687*0.728**0.243XET活性XET activity0.5420.5120.6030.509Expansins活性Expansins activity0.623**0.626**0.671**0.716**

*，P<0.05;**，P<0.01.

XET活性與根系總長、根表面積、根體積、根尖數(shù)無顯著相關(guān)性，但與CsXTH23基因的表達(dá)量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。CsEXPB14基因表達(dá)量與茶樹根系總長、根表面積、根體積、根尖數(shù)無顯著相關(guān)性。CsEXLA8基因表達(dá)量與茶樹根系總長、根體積均呈顯著(P<0.05)正相關(guān)，與根表面積、根尖數(shù)呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。Expansins活性與根系總長、根表面積、根體積、根尖數(shù)均呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，且與CsEXPB14基因表達(dá)量亦呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。

3 討論

鋁作為地殼中分布最廣的金屬元素，在酸性土壤條件下，容易因土壤中的鋁含量過高而對植物造成毒害，從而抑制植物根系的生長。研究報道，低濃度的鋁即顯著抑制水稻、玉米等作物根系的生長[28-29]。然而，植物對鋁的抗性會因植物種類不同或基因型不同而有顯著差異。茶樹作為典型的聚鋁植物，對鋁具有很高的耐受性，其成熟葉片中的鋁含量可高達(dá)2%，且已有的研究結(jié)果表明，一定濃度的鋁可促進(jìn)茶樹根系的生長[2-4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無鋁對照相比，加鋁處理，尤其是0.4 、1.0mmol·L-1的鋁處理，能夠顯著誘導(dǎo)根系的膨大、伸長、分生，從而促進(jìn)茶樹根系的生長。這與吳瓊鴦等[2]、王敏等[4]的研究結(jié)果一致。表明適度的鋁對茶樹根系不僅沒有產(chǎn)生毒害作用，反而有較好的促進(jìn)作用。但隨著鋁濃度的增加(>1.0mmol·L-1)，這種促進(jìn)作用逐漸減弱，表明茶樹根系對鋁的響應(yīng)存在生理閾值。

通過對根系生長相關(guān)細(xì)胞壁關(guān)鍵蛋白XET與Expansins蛋白活性的分析，發(fā)現(xiàn)低于1.0mmol·L-1鋁濃度處理下，XET和Expansins蛋白活性顯著增強(qiáng)，XET活性直到4.0mmol·L-1鋁條件下才受顯著抑制。對于不耐鋁的擬南芥等植物來說，50μmol·L-1的鋁即可使其根系中的XET酶鈍化[24，30]，由此可見，茶樹根系中XET酶的鋁耐受性要遠(yuǎn)高于擬南芥等，0.4mmol·L-1的鋁處理不僅沒有抑制XET酶和Expansins蛋白的活性，反而增強(qiáng)了其蛋白活性。推測茶樹XET酶和Expansins蛋白對鋁響應(yīng)存在特異性的分子機(jī)制，這是今后應(yīng)予研究的重點(diǎn)。大量研究表明，XET和Expansins活性與植物生長密切相關(guān)，在干旱脅迫下，伸展蛋白活性與小麥胚芽鞘長度之間的相關(guān)性達(dá)極顯著水平[31]，XET活性與生長速率呈現(xiàn)密切相關(guān)性[32-34]。本研究表明，Expansins活性與根系總長、根表面積、根體積、根尖數(shù)均呈顯著正相關(guān)，可見茶樹中Expansins活性的增強(qiáng)可起到促進(jìn)茶樹根系生長的作用。

通過對茶樹根系XTHs和Expansins基因表達(dá)的分析，發(fā)現(xiàn)0.4mmol·L-1鋁濃度下CsXTH14基因表達(dá)顯著上調(diào)，而擬南芥中50μmol·L-1濃度鋁即已抑制XTH14基因表達(dá)[30]，可見茶樹根系XTH14基因?qū)︿X的耐受性遠(yuǎn)高于擬南芥。楊亮[35]研究表明，XTH14在擬南芥根系、種子、幼苗、胚根中表達(dá)豐度較高，在其他組織器官中表達(dá)豐度均較低，推測XTH14可能在幼苗根系生長過程中具有重要作用。本研究顯示，CsXTH14與茶樹根尖數(shù)、根表面積和根體積存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，表明適當(dāng)?shù)匿X處理可誘導(dǎo)XTH14基因的表達(dá)，以促進(jìn)不定根的形成、根細(xì)胞的膨大，從而促進(jìn)根系的生長。XTH23與根系生長無顯著相關(guān)性，表明不同XTHs基因家族成員對鋁的響應(yīng)也具有差異性。與茶樹根系生長相關(guān)的Expansins基因家族中，CsEXLA8與CsEXPB14基因表達(dá)量在0.4mmol·L-1的鋁濃度下最高。Che等[26]在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，鋁處理誘導(dǎo)了水稻根系OsEXPA10的上調(diào)表達(dá)，敲除株系的根系生長受到顯著抑制，表明鋁誘導(dǎo)OsEXPA10基因表達(dá)參與了根系生長。本研究表明，CsEXLA8基因表達(dá)量與茶樹根系總長、根表面積、根體積、根尖數(shù)均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這與在大豆、水稻、小麥上的研究結(jié)果EXP基因表達(dá)與生長密切相關(guān)[19，36-38]的結(jié)論是一致的。由此可見，鋁可以誘導(dǎo)CsEXLA8基因表達(dá)，促進(jìn)茶樹根細(xì)胞膨大、伸長及不定根形成，從而促進(jìn)茶樹根系的生長。

綜上，茶樹對不同鋁濃度的響應(yīng)存在明顯差異，0.4、1.0mmol·L-1的鋁處理均能促進(jìn)茶樹根系的生長，當(dāng)鋁濃度增加至4.0mmol·L-1時，其對茶樹根系生長的促進(jìn)作用變?nèi)?。根系生長與XTHs和Expansins基因表達(dá)及相應(yīng)的蛋白活性呈正相關(guān)關(guān)系，一定濃度的鋁(≤1.0mmol·L-1)處理可誘導(dǎo)根系XTHs和Expansins基因表達(dá)上調(diào)，提高XET和Expansins活性，促進(jìn)茶樹根細(xì)胞膨大、伸長及不定根形成，從而促進(jìn)茶樹根系的生長。

：

[1] TAYLOR G J.Current views of the aluminum stress response:the physiological basis of tolerance[J].CurrentTopicsinPlantBiochemistryandPhysiology，1991，10:57-93.

[2] 吳瓊鴦，鄭偉偉，羅亮，等.鋁對茶樹根系生理的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(3):80-82.

WU Q Y，ZHENG W W，LUO L，et al.Effect of aluminum on the physiological characteristics of tea root system[J].HubeiAgriculturalSciences，2005(3):80-82.(in Chinese with English abstract)

[3] 于翠平，潘志強(qiáng)，陳杰，等.鋁對茶樹生長與生理特性影響的研究[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2012，18(1):182-187.

YU C P，PAN Z Q，CHEN J，et al.Effects of Al3+on growth and physiological characteristics of tea plant(Camelliasinensis)[J].PlantNutritionandFertilizerScience，2012，18(1):182-187.(in Chinese with English abstract)

[4] 王敏，寧秋燕，石元值.茶樹幼苗對不同濃度鋁的生理響應(yīng)差異研究[J].茶葉科學(xué)，2017，37(4):356-362.

WANG M，NING Q Y，SHI Y Z.Study on physiological response of tea plant(Camelliasinensis) seedlings to different aluminum concentrations[J].JournalofTeaScience，2017，37(4):356-362.(in Chinese with English abstract)

[5] 潘根生，MASAKI TSUJI，小西茂毅.茶根尖細(xì)胞各胞器分部的分離及其鋁的分布[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1991，17(3):255-258.

PAN G S，MASAKI T，SHIGEKI K.Isolation of cell organelles from the tip-root cells of tea and their distribution of aluminum[J].ActaAgriculturacUniversitatisZhejiangensis，1991，17(3):255-258.(in Chinese with English abstract)

[6] 劉騰騰，郜紅建，宛曉春，等.鋁對茶樹根細(xì)胞膜透性和根系分泌有機(jī)酸的影響[J].茶葉科學(xué)，2011，31(5):458-462.

LIU T T，GAO H J，WAN X C，et al.Impacts of aluminum on root cell membrane permeability and organic acids in root exudates of tea plant[J].JournalofTeaScience，2011，31(5):458-462.(in Chinese with English abstract)

[7] 小西茂毅.鋁對茶樹生長的促進(jìn)作用[J].茶葉，1995，21(3):18-22.

SHIGEKI K.Promotion effect of aluminum on root growth of tea plant[J].JournalofTea，1995，21(3):18-22.(in Chinese)

[8] FUNG K F，CARR H P，ZHANG J H，et al.Growth and nutrient uptake of tea under different aluminum concentrations[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture，2008，88(9):1582-1591.

[9] HAJIBOLAND R，BARCELO J，POSCHENRIEDER C，et al.Amelioration of iron toxicity:a mechanism for aluminum-induced growth stimulation in tea plants[J].JournalofInorganicBiochemistry，2013，128:183-187.

[10] XU Q S，WANG Y，DING Z T，et al.Aluminum induced metabolic responses in two tea cultivars[J].PlantPhysiologyandBiochemistry，2016，101:162-172.

[11] LI Y，HUANG J，SONG X W，et al.An RNA-Seq transcriptome analysis revealing novel insights into aluminum tolerance and accumulation in tea plant[J].Planta，2017，246(1):91-103.

[12] XU Q S，WANG Y，DING Z T，et al.Aluminum induced physiological and proteomic responses in tea(Camelliasinensis) roots and leaves[J].PlantPhysiologyandBiochemistry，2017，115:141-151.

[13] ROSE J K C，BRAAM J，F(xiàn)RY S C，et al.The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis:current perspectives and a new unifying nomenclature[J].PlantandCellPhysiology，2002，43(12):1421-1435.

[14] BRAY E A.Genes commonly regulated by water-deficit stress inArabidopsisthaliana[J].JournalofExperimentalBotany，2004，55(407):2331-2341.

[15] MCQUEEN-MASON S，COSGROVE D J.Disruption of hydrogen bonding between plant cell wall polymers by proteins that induce wall extension[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，1994，91(14):6574-6578.

[16] MCQUEEN-MASON S，COSGROVE D J.Expansin mode of action on cell walls:analysis of wall hydrolysis，stress relaxation，and binding[J].PlantPhysiology，1995，107(1):87-100.

[17] VISSENBERG K，F(xiàn)RY S C，PAULY M，et al.XTH acts at the microfibril-matrix interface during cell elongation[J].JournalofExperimentalBotany,2005，56(412):673-683.

[18] OSATO Y，YOKOYAMA R，NISHITANI K.A principal role forAtXTH18 inArabidopsisthalianaroot growth:a functional analysis using RNAi plants[J].JournalofPlantResearch，2006，119(2):153-162.

[19] LEE D K，AHN J H，SONG S，et al.Expression of an expansin gene is correlated with root elongation in soybean[J].PlantPhysiology，2003，131(3):985-997.

[20] Lü P T，KANG M，JIANG X Q，et al.RhEXPA4，a rose expansin gene，modulates leaf growth and confers drought and salt tolerance toArabidopsis[J].Planta，2013，237(6):1547-1559.

[21] YU Z M，KANG B，HE X W，et al.Root hair-specific expansins modulate root hair elongation in rice[J].ThePlantJournal，2011，66(5):725-734.

[22] MA N，WANG Y，QIU S，et al.Overexpression ofOsEXPA8，a root-specific gene，improves rice growth and root system architecture by facilitating cell extension[J].PloSOne，2013，8(10):e75997.

[23] ZOU H，WEN Y，ZANG G，et al.OsEXPB2，a β-expansin gene，is involved in rice root system architecture[J].MolecularBreeding，2015，35:41.

[24] YANG L J，ZHU X F，PENG Y X，et al.Cell wall hemicellulose contributes significantly to aluminum adsorption and root growth inArabidopsis[J].PlantPhysiology，2011，155(4):1885-1892.

[25] ZHU X F，SHI Y Z，LEI G J，et al.XTH31，encoding aninvitroXEH/XET active enzyme，regulates aluminum sensitivity by modulatinginvivoXET action，cell wall xyloglucan content，and aluminum binding capacity inArabidopsis[J].ThePlantCell，2012，24(11):4731-4747.

[26] CHE J，YAMAJI N，SHEN R F，et al.An Al-inducible expansin gene，OsEXPA10 is involved in root cell elongation of rice[J].ThePlantJournal，2016，88(1):132-142.

[27] COSGROVE D J，LI Z C.Role of expansins in cell enlargement of oat coleoptiles:analysis of developmental gradients and photocontrol[J].PlantPhysiology，1993，103:1321-1328.

[28] 鮑學(xué)敏，趙學(xué)強(qiáng)，肖作義，等.鋁對不同耐鋁水稻品種根系生長和養(yǎng)分吸收的影響[J].植物生理學(xué)報，2015，51(12):2157-2162.

BAO X M，ZHAO X Q，XIAO Z Y，et al.Effects of aluminum on the root growth and nutrient uptake of two rice varieties with different aluminum tolerances[J].PlantPhysiologyJournal，2015，51(12):2157-2162.(in Chinese with English abstract)

[29] 曾巧英，王蘊(yùn)波，楊泉女，等.不同濃度鋁脅迫對甜玉米幼苗生長的影響研究[J].佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，27(2):5-8.

ZENG Q Y，WANG Y B，YANG Q N，et al.Influence of different aluminum(Al) stress on the growth of sweet corn seedling[J].JournalofFoshanUniversity(NaturalScienceEdition)，2009，27(2):5-8.(in Chinese with English abstract)

[30] 朱曉芳.擬南芥細(xì)胞壁半纖維素結(jié)合鋁的機(jī)制及其調(diào)控[D].杭州:浙江大學(xué)，2014.

ZHU X F.The binding of aluminum by cell wall hemicelluloses and its regulation inArabidopsis[D].Hangzhou:Zhejiang University，2014.(in Chinese with English abstract)

[31] 趙美榮，李永春，劉輝，等.抗旱性不同的小麥擴(kuò)展蛋白活性及基因表達(dá)分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(1):108-110.

ZHAO M R，LI Y C，LIU H，et al.Analysis of expansins activity and gene expression with different drought resistance wheat[J].JiangsuAgriculturalSciences，2016，44(1):108-110.(in Chinese)

[32] WU Y J，JEONG B R，F(xiàn)RY S C，et al.Change in XET activities，cell wall extensibility and hypocotyl elongation of soybean seedlings at low water potential[J].Planta，2005，220(4):593-601.

[33] ALONSO-SIMON A，GARCIA-ANGULO P，ENCINA A E，et al.Increase in XET activity in bean(PhaseolusvulgarisL.) cells habituated to dichlobenil[J].Planta，2007，226(3):765-771.

[34] POTTER I，F(xiàn)RY S C.Changes in xyloglucan endotransglycosylase(XET) activity during hormone-induced growth in lettuce and cucumber hypocotyls and spinach cell suspension cultures[J].JournalofExperimentalBotany，1994，45:1703-1710.

[35] 楊亮.XET/XTH功能及基因家族表達(dá)模式的研究進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)，2011(3):65-67.

YANG L.Study process of XET/XTH function and gene family expression patterns[J].JilinAgricultural，2011(3):65-67.(in Chinese)

[36] CHO H T，KENDE H.Expression of expansin genes is correlated with growth in deepwater rice[J].PlantCell，1997，9:1661-1671.

[37] GAO Q，ZHAO M R，LI F，et al.Expansins and coleoptile elongation in wheat[J].Protoplasma，2008，233:73-81.

[38] XING S C，LI F，GUO Q F，et al.The involvement of an expansin geneTaEXPB23 from wheat in regulating plant cell growth[J].BiologiaPlantarum，2009，53(3):429-434.

ResponsesofExpansinsandXTHstodifferentaluminumconcentrationainrootsofteaplant[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]

NING Qiuyan1，2，F(xiàn)AN Kai1，WANG Min1，2，SHI Yuanzhi1，*

(1.TeaResearchInstitute，ChineseAcademyofAgricultureSciences，KeyLaboratoryforTeaPlantBiologyandResourceUtilization，MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Hangzhou310008，China;2.GraduateSchool，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China)

Abstract:In order to investigate the effect of aluminium(Al) on root growth of tea plants [Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]，Anjibaicha tea plant was selected as study material with different Al concentrations for 28d.Then，the phenotypic differences and parameters of roots，activities of the Expansins and xyloglucan endotransglucosylase(XET)，and the gene expression level ofExpansinsandXTHs，which were related with root growth and key proteins of cell wall were assayed.The results showed that the Al could promote the root growth of tea plant on phenotypic and parameters.The treatment with 0.4，1.0mmol·L-1Al showed significant(P<0.05) difference with control，as the root total length was increased by 206% and 209%，respectively，the number of root tips was increased by 175% and 166%，respectively，the root surface area was increased by 227% and 286%，respectively，and the root volume was increased by 246% and 385%，respectively.Correspondingly，the gene expression level ofCsEXPB14 and the expansins-like geneCsEXLA8 in the roots treated with 0.4mol·L-1Al were significantly(P<0.05) higher than those without Al or with 4.0mmol·L-1Al.The expansins activity in the roots with 0.4mmol·L-1Al was higher than other treatments and was increased by 84.3% as compared to the control.The expression level ofCsXTH14 in the roots with 0.4，1.0mmol·L-1Al were significantly(P<0.05) higher than the other treatments，and XET activity was increased with the elevated Al concentration，and was significantly(P<0.05) inhibited until the Al concentration reached up to 4.0mmol·L-1.The gene expression level ofExpansinsandXTHs，the activities of XET and Expansins showed a positive correlation with root growth of tea plant，which indicated that Al(≤1mmol·L-1) could increase XET and Expansins activity by promoting the gene expression ofExpansinsandXTHs，hence，promote root growth of tea plants.

Key words:environmental stress;plant nutrition;beverage crop;gene expression;root growth

中圖分類號：S571.1

A

文章編號：1004-1524(2018)06-0961-09

收稿日期：2017-09-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31572199);中國農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2017-TRICAAS)

作者簡介：寧秋燕(1991—)，女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事茶樹生理與營養(yǎng)方面的研究。E-mail:861731507@qq.com

，石元值，E-mail:shiyz@tricaas.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.11

(責(zé)任編輯高 峻)