侯曉鈺，胥建輝，唐 瑜，羅 蓉，劉 暢，張 潔

1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 體溫與炎癥四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)

精氨酸加壓素(arginine vasopressin, AVP)是一種九肽神經(jīng)激素，它既可以作為激素被分泌到外周發(fā)揮維持體液、血壓平衡的作用，也可以作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)被釋放到中樞發(fā)揮調(diào)控情緒、學(xué)習(xí)記憶和社會(huì)行為的作用[1]。此外，AVP還在正常體溫調(diào)節(jié)和退熱中發(fā)揮了重要作用[2-3]。研究[2-4]表明，不論是外周還是中樞應(yīng)用AVP均可以引起正常體溫降低或?qū)е轮嗵且鸬拇笫蟀l(fā)熱效應(yīng)減弱，但是目前AVP引起退熱的機(jī)制還未完全闡明。

下丘腦視前區(qū)是體溫調(diào)節(jié)中樞，這里分布著可以被下丘腦局部溫度改變激活的熱敏神經(jīng)元和冷敏神經(jīng)元，以及對局部溫度改變無響應(yīng)的溫度不敏感神經(jīng)元。既往的研究[5-6]表明，這些不同種類的神經(jīng)元在正常體溫調(diào)節(jié)與發(fā)熱反應(yīng)中扮演了重要角色。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是一種關(guān)鍵的內(nèi)源性致熱因子，研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，PGE2可降低視前區(qū)熱敏神經(jīng)元的放電頻率，增加溫度不敏感神經(jīng)元或冷敏神經(jīng)元的放電頻率，提示PGE2的致熱作用可能與此有關(guān)。與此相反，AVP可增加視前區(qū)熱敏神經(jīng)元的放電頻率，降低溫度不敏感神經(jīng)元和冷敏神經(jīng)元的放電頻率[9]，這就提示AVP可能影響PGE2對視前區(qū)神經(jīng)元的作用。前期研究[10]已經(jīng)證明，AVP能夠?qū)筆GE2對內(nèi)側(cè)視前區(qū)熱敏神經(jīng)元和溫度不敏感神經(jīng)元的作用，但AVP是否能夠影響PGE2對視前區(qū)冷敏神經(jīng)元的作用還未見報(bào)道。因此，通過應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，本研究觀察了AVP對PGE2引起視前區(qū)冷敏神經(jīng)元放電頻率變化的影響。此外，通過應(yīng)用AVP的V1a受體拮抗劑，還測試了AVP V1a受體是否在其中發(fā)揮了一定的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

健康純系雄性SD大鼠87只，每只體質(zhì)量250 g左右，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。 NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、MgSO4、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖和戊巴比妥鈉均購自成都科龍化工試劑廠。AVP、AVP V1a受體阻斷劑、四乙酸(EGTA)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、Mg-ATP和Na2GTP均購自Sigma公司，玻璃電極購自Sutter公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腦片制備 按照以往研究[8]報(bào)道的方法，4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg, ip)麻醉大鼠，斷頭取腦，置于充以混合氧(95% CO2和5% O2)的0～4 ℃人工腦脊液中冷凍，1～2 min后取出修塊，用少量502 膠將修好的組織塊固定在切片機(jī)上，切成300 μm厚的腦薄片，選擇含有視前區(qū)的腦片，在室溫下于充以混合氧的人工腦脊液中孵育2 h左右備用。人工腦脊液成分：124 mmol/L NaCl，26 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L KCl，2.4 mmol/L CaCl2，1.3 mmol/L MgSO4，1.24 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L葡萄糖(滲透壓調(diào)至295～300 mmol/L，pH值調(diào)至7.2～7.4)。

1.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 在正置微分干涉相差顯微鏡(FN1，Nikon，Japan)下挑選狀態(tài)良好的細(xì)胞，選擇入水電阻5 M歐左右的玻璃電極進(jìn)行細(xì)胞封接。調(diào)整微操縱器(MPC-200， Sutter Instruments, USA)使玻璃電極靠近細(xì)胞，在電極入水直至電極接觸細(xì)胞之前持續(xù)給予10～30 mm水柱正壓，在接觸細(xì)胞時(shí)放開正壓，通過細(xì)胞自然回彈或者負(fù)壓吸引封堵電極口形成G歐阻抗封接，封接穩(wěn)定后電擊(ZAP)破膜，此后切換至電流鉗模式(I=0)記錄視前區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電，電流信號經(jīng)放大器(EPC10，HEKA，Germany)放大后顯示在計(jì)算機(jī)上。電極內(nèi)液成分：130 mmol/L 葡萄糖酸鉀，10 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES，2 mmol/L Mg-ATP，2 mmol/L Na2GTP，和1 mmol/L CaCl2(滲透壓調(diào)至295～300 mmol/L，pH值調(diào)至7.2～7.4)。

1.2.3 神經(jīng)元溫度敏感性的鑒別和給藥 根據(jù)以往的文獻(xiàn)[9, 11]報(bào)道，通過改變浴液溫度鑒別視前區(qū)冷敏感神經(jīng)元。設(shè)定溫度控制器TC-324B(warner instruments, USA)為45～50 ℃，將記錄浴槽的溫度控制在37 ℃左右，改變另1個(gè)溫度控制器 CL-100(warner instruments, USA)的設(shè)定溫度，即可使浴液溫度快速地在28～42 ℃變化，根據(jù)溫度對神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，計(jì)算溫度敏感系數(shù)：以溫度為橫坐標(biāo)，單位時(shí)間內(nèi)的放電個(gè)數(shù)為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，線性擬合后的斜率(m值)即為溫度敏感系數(shù)，它表示單位時(shí)間和溫度內(nèi)的放電個(gè)數(shù)，即imp/S·℃(impluse/S·℃)。根據(jù)文獻(xiàn)[5]定義，m值≤-0.6為冷敏神經(jīng)元。鑒定神經(jīng)元溫度敏感性類型后，向人工腦脊液中加入AVP(1 μmol)或 AVP(1 μmol)+PGE2(1 μmol)或AVP(1 μmol)+PGE2(1 μmol)+AVP V1a(1 μmol)受體阻斷劑，加藥時(shí)間為5 min，此后用人工腦脊液洗脫10 min，以充分去除藥物對神經(jīng)元的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PGE2對冷敏神經(jīng)元的作用

實(shí)驗(yàn)程序完成后，共有13個(gè)冷敏神經(jīng)元仍保持活性，其平均放電頻率為(7.3±0.78)imp/s，不同藥物對所有冷敏神經(jīng)元放電頻率的影響如下所示(圖1)，加藥后典型的冷敏神經(jīng)元放電頻率改變?nèi)缦滤?圖2A，圖3A和圖4A)。在加入PGE2后，有8個(gè)冷敏神經(jīng)元的放電頻率明顯升高，其平均放電頻率上升了(69.6±39.7)%(t=2.731,P=0.016)(圖1和圖2B)；3個(gè)冷敏神經(jīng)元的放電頻率明顯下降，其平均放電頻率下降了(90.0±21.49)%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.619,P=0.058)(圖1和圖3B)；2個(gè)冷敏神經(jīng)元的放電頻率保持不變(t=0.056,P=0.959)(圖1和圖4B)。

圖1 不同藥物對大鼠視前區(qū)冷敏神經(jīng)元放電頻率的影響

注：A～C：描述了冷敏神經(jīng)元分別應(yīng)用不同藥物前后的放電頻率；散點(diǎn)處于虛線以上或以下分別表明對應(yīng)的神經(jīng)元加藥后放電增加或減少；“○”,“△”,“□”分別代表了加PGE2后放電頻率增加、減少或不變的冷敏神經(jīng)元；V1aant：AVP V1a受體拮抗劑

2.2 AVP對PGE2引起冷敏神經(jīng)元放電變化的影響

為了研究AVP對PGE2引起冷敏神經(jīng)元放電變化的影響，本研究用人工腦脊液灌流10 min洗脫P(yáng)GE2的作用后，又在灌流液中加入了PGE2和AVP混合液。結(jié)果顯示，PGE2引起放電頻率上升的冷敏神經(jīng)元在加入PGE2和AVP混合液后，其平均放電變化轉(zhuǎn)為下降(n=8,P<0.05)，說明AVP反轉(zhuǎn)了PGE2引起的冷敏神經(jīng)元放電活性增強(qiáng)(圖2A和圖2C)。

此后，為了研究AVP的作用是否由AVP V1a受體介導(dǎo)，在用人工腦脊液灌流10 min洗脫AVP和PGE2混合液的作用后，又在灌流液中加入了PGE2、AVP和AVP V1a受體阻斷劑混合液。結(jié)果所示，在加入了PGE2、AVP和V1a受體拮抗劑后，神經(jīng)元的平均放電變化與PGE2和AVP混合液引起的放電變化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,P<0.05)，而且與PGE2引起的放電變化相似(n=8,P>0.05)，表明V1a受體拮抗劑廢除了AVP對PGE2引起神經(jīng)元放電改變的影響，提示V1a受體介導(dǎo)了AVP的作用(圖2A和圖2C)。

3個(gè)PGE2引起放電頻率下降的神經(jīng)元在分別加入了AVP和PGE2混合液以及AVP、PGE2和AVP V1a受體拮抗劑混合液后的平均放電變化與加入PGE2后引起的放電變化相似(n=3,P=0.934)，表明AVP和AVP V1a受體拮抗劑不能影響PGE2引起的冷敏神經(jīng)元活性下降(圖3A和圖3C)。與此相似，其余2個(gè)對PGE2沒有響應(yīng)的冷敏神經(jīng)元，在分別加入了AVP和PGE2混合液以及AVP、PGE2和AVP V1a受體拮抗劑混合液后，其平均放電變化依然無明顯改變(n=2,P=0.921)，說明AVP和AVP V1a受體拮抗劑對這類神經(jīng)元的活性無明顯影響(圖4A和圖4C)。

圖2 AVP通過V1a受體反轉(zhuǎn)了PGE2引起的大鼠視前區(qū)冷敏神經(jīng)元自發(fā)放電頻率增加

注：A：PGE2激活的冷敏神經(jīng)元在加入AVP和PGE2混合液以及AVP、PGE2和V1aant混合液后的典型放電改變圖；B：PGE2激活的冷敏神經(jīng)元加入PGE2后的平均放電頻率改變；C：PGE2激活的冷敏神經(jīng)元分別加入PGE2、AVP和PGE2混合液以及AVP、PGE2和AVP V1a受體拮抗劑混合液后的平均放電變化；*P<0.05

圖3 AVP和V1a受體拮抗劑無法改變PGE2引起的大鼠視前區(qū)冷敏神經(jīng)元放電頻率降低

注：A：PGE2抑制的冷敏神經(jīng)元在加入AVP和PGE2混合液以及AVP、PGE2和V1aant混合液后的典型放電改變圖；B：PGE2抑制的冷敏神經(jīng)元加入PGE2的平均放電頻率改變；C：PGE2抑制的冷敏神經(jīng)元分別加入PGE2、AVP和PGE2混合液，以及AVP、PGE2和V1aant混合液后的平均放電變化

圖4 AVP和V1a受體拮抗劑無法影響對PGE2無響應(yīng)的大鼠視前區(qū)冷敏神經(jīng)元的放電頻率

注：A：對PGE2無響應(yīng)的冷敏神經(jīng)元在加入AVP和PGE2混合液以及AVP、PGE2和V1aant混合液后的典型放電改變圖；B：對PGE2無響應(yīng)的冷敏神經(jīng)元加入PGE2前后的平均放電頻率；C：對PGE2無響應(yīng)的冷敏神經(jīng)元分別加入PGE2、AVP和PGE2混合液，以及AVP、PGE2和V1aant混合液后的平均放電變化

3 討論

發(fā)熱是機(jī)體面臨感染時(shí)的一種防御性體溫升高，脂多糖引起的發(fā)熱主要是由致熱因子PGE2介導(dǎo)。研究[12]發(fā)現(xiàn)，往視前區(qū)微量注射PGE2可以引起發(fā)熱反應(yīng)，而選擇性地刪除視前區(qū)的PGE2EP3受體基因，可以阻斷大多數(shù)PGE2和脂多糖引起的發(fā)熱，提示PGE2通過影響視前區(qū)神經(jīng)元活性介導(dǎo)脂多糖引起的發(fā)熱。本實(shí)驗(yàn)首先觀察了PGE2對視前區(qū)冷敏神經(jīng)元活性的影響，結(jié)果表明，PGE2可以增加冷敏神經(jīng)元的放電頻率，這與早年Gordon等[8]研究的結(jié)果相似，但他們記錄到冷敏神經(jīng)元放電頻率增加的比例和增加的幅度都比本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果高。本實(shí)驗(yàn)在大鼠視前區(qū)腦片上用全細(xì)胞膜片鉗記錄方式發(fā)現(xiàn)，PGE2能夠使61.5%(8/13)的冷敏神經(jīng)元放電頻率增加，且平均增幅為(69.6±39.7)%；而他們在未麻醉的新西蘭兔上，用細(xì)胞外記錄方式發(fā)現(xiàn)PGE2能夠增加83.3%(5/6)的冷敏神經(jīng)元的放電頻率，且平均增幅高達(dá)(190±88)%。引起這些差異的原因可能與實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物種類或神經(jīng)元放電記錄方式不同有關(guān)。視前區(qū)的溫度敏感神經(jīng)元可以整合來自外周和下丘腦局部的溫度信號，并進(jìn)一步通過下行通路控制機(jī)體的產(chǎn)熱或散熱反應(yīng)，因而在體溫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用[5]。目前，有研究[5-6]認(rèn)為，激活熱敏神經(jīng)元可以引起產(chǎn)熱減少、散熱增加，而激活冷敏神經(jīng)元?jiǎng)t可能引起產(chǎn)熱增加、散熱減少。因此，PGE2增加冷敏神經(jīng)元的活性可能有助于其引起發(fā)熱效應(yīng)，而AVP能夠反轉(zhuǎn)PGE2引起的視前區(qū)冷敏神經(jīng)元活性增強(qiáng)則可能有助于AVP發(fā)揮退熱效應(yīng)。

AVP主要由下丘腦視上核、室旁核合成。研究[13-14]表明，腹腔注射脂多糖、體核溫度上升均可引起室旁核的AVP能神經(jīng)元釋放AVP。另一方面，視前區(qū)被大量可能源自室旁核的AVP免疫反應(yīng)陽性纖維支配[15]。此前研究[10]發(fā)現(xiàn)，AVP能夠?qū)筆GE2引起的大鼠內(nèi)側(cè)視前區(qū)熱敏和溫度不敏感神經(jīng)元活性改變。本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步證明了，AVP還能夠反轉(zhuǎn)PGE2引起的視前區(qū)冷敏神經(jīng)元活性增強(qiáng)。這就提示，在發(fā)熱的時(shí)候AVP很可能從室旁核釋放到視前區(qū)，然后在此對抗PGE2引起的視前區(qū)溫度敏感和溫度不敏感神經(jīng)元活性改變，以此對抗PGE2的致熱作用。與這個(gè)理論一致，電生理刺激室旁核可以減弱脂多糖引起的發(fā)熱效應(yīng)[2]；此外，激活室旁核的神經(jīng)元可以反轉(zhuǎn)視前區(qū)微量注射PGE2引起的棕色脂肪組織產(chǎn)熱增加[16]。這些資料表明，AVP很有可能通過對抗PGE2對視前區(qū)神經(jīng)元的作用參與機(jī)體的內(nèi)源性退熱和發(fā)熱上限的形成。

AVP主要有V1a、V1b、V23種不同的受體，其中V1a受體在中樞表達(dá)最為廣泛，AVP的一些中樞功能也多由其介導(dǎo)[1]。V1a受體在視前區(qū)也有大量表達(dá)[17]。以前研究[9]表明，AVP V1a受體參與調(diào)控了視前區(qū)冷敏神經(jīng)元的緊張性放電，最近又發(fā)現(xiàn)V1a受體介導(dǎo)了AVP對PGE2引起內(nèi)側(cè)視前區(qū)熱敏和溫度不敏感神經(jīng)元活性改變的對抗作用[10]。因此，猜測AVP對PGE2引起冷敏神經(jīng)元活性增強(qiáng)的反轉(zhuǎn)作用很可能也是由V1a受體介導(dǎo)的。結(jié)果與設(shè)想一致，此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)V1a受體拮抗劑阻斷了AVP對PGE2引起視前區(qū)冷敏神經(jīng)元改變的影響，說明AVP確實(shí)通過V1a受體反轉(zhuǎn)了PGE2對視前區(qū)冷敏神經(jīng)元的作用。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，Kovacs等[18]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用V1a受體拮抗劑可以阻斷中樞應(yīng)用AVP引起的退熱作用，說明中樞應(yīng)用AVP引起的退熱作用是由V1a受體介導(dǎo)的。這就提示AVP的退熱效應(yīng)可能與AVP通過V1a受體反轉(zhuǎn)PGE2引起的視前區(qū)冷敏神經(jīng)元活性增強(qiáng)有關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)并未應(yīng)用藥物阻斷突觸傳遞，所以還不清楚AVP與V1a受體結(jié)合后是通過影響突觸傳遞還是通過直接影響視前區(qū)神經(jīng)元的細(xì)胞膜電生理特性來反轉(zhuǎn)PGE2引起的視前區(qū)冷敏神經(jīng)元活性改變，這個(gè)問題將會(huì)在下一步的研究中去確認(rèn)。

在此次實(shí)驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)有15.4%(2/13)的冷敏神經(jīng)元對PGE2并無響應(yīng)，23.1%(3/13)的冷敏神經(jīng)元在加入PGE2后活性下降。此前也有學(xué)者[19]在大鼠視前區(qū)腦片上用細(xì)胞外記錄方式記錄到了3個(gè)冷敏神經(jīng)元對PGE2的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)PGE2僅增加其中1個(gè)冷敏神經(jīng)元的放電頻率，其余2個(gè)冷敏神經(jīng)元對PGE2并無響應(yīng)。這就提示冷敏神經(jīng)元中存在著不同的亞型，這些對PGE2有著不同響應(yīng)的冷敏神經(jīng)元有可能在PGE2介導(dǎo)的發(fā)熱進(jìn)程中發(fā)揮了不同的作用。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AVP和V1a受體拮抗劑均無法影響PGE2對這些冷敏神經(jīng)元的作用，提示這兩類冷敏神經(jīng)有可能并未參與AVP的退熱作用。

綜上所述，本研究主要應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PGE2增加了61.5%的冷敏神經(jīng)元的放電頻率，平均增幅為(69.6±39.7)%；AVP可以反轉(zhuǎn)PGE2引起的冷敏神經(jīng)元放電頻率上升；AVP V1a受體介導(dǎo)了AVP的這個(gè)作用。這些結(jié)果可能為AVP退熱的中樞機(jī)制提供了新的證據(jù)。

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