徐百升， 夏 璐 ， 胡春艷

1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液凈化中心(開封 475000)；2.河南省人民醫(yī)院 血液凈化中心 (鄭州 450003)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是一種常見且嚴重的糖尿病微血管并發(fā)癥，發(fā)病率20%～40%[1]，是導(dǎo)致其死亡的主要原因之一，因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療對控制延緩DN發(fā)展極其重要。目前，尚未明確DN的確切發(fā)病機制，多數(shù)研究[2]認為，與炎癥反應(yīng)、代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)改變和遺傳等多種因素有關(guān)。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，糖尿病高血糖可誘發(fā)產(chǎn)生多種炎癥細胞因子和趨化因子，繼而引起腎小球細胞外基質(zhì)積聚，腎小球硬化，最終在DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。近年來，新發(fā)現(xiàn)的作用于各種腎臟疾病的細胞因子有細胞核因子-κB(NF-κB)，其激活是由晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與糖基化終末產(chǎn)物特異性受體(RAGE)結(jié)合而實現(xiàn)的，進而介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進多種細胞因子及生長因子的合成和釋放，誘發(fā)多種病理變化，如細胞基質(zhì)異常增生、炎癥反應(yīng)擴大等[4]，共同參與DN發(fā)展過程。雷公藤多苷(TWP)是雷公藤的有效成分，具有多種作用，包括抗炎、免疫抑制、抗感染等，在臨床上廣泛用于多種原發(fā)性及繼發(fā)性腎小球疾病治療[5]。將TWP用于DN的治療，發(fā)現(xiàn)DN患者免疫功能提高，同時蛋白尿降低，在DN發(fā)生過程中發(fā)揮有效拮抗作用。本研究通過觀察TWP對DN大鼠RAGE/NF-κB信號通路的影響，旨在探究TWP對DN大鼠腎損傷保護作用的可能機制，為尋求新的DN治療方案提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供[動物許可證號 SCXK(滬)2012-0002]的74只6～8周齡的健康雄性SD大鼠，大鼠體質(zhì)量174～208(184.6±7.2)g；飼養(yǎng)條件：溫度、相對濕度分別為19～25 ℃、40%～70%；飲食飲水自由；高糖高脂飼料成分：脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物各占22%、20%、48%；基礎(chǔ)飼料成分：脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物各占5%、20%、53%。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準后進行。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ)(溶于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.4)購自美國 Sigma公司；TWP片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，國藥準字H20053912)。

1.3 DN大鼠模型建立、分組及給藥方法

高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，單次腹腔注射STZ(55 mg/kg)，STZ采用枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L)溶解，維持pH值在4.4，72 h后于空腹狀態(tài)下取尾靜脈血，檢測血糖含量。注射STZ 1周后，收集大鼠24 h后的尿液以測定24 h 尿蛋白定量(UTP)、尿糖。若血糖超過16.7 mmol/L(即≥16.7 mmol/L)、24 h UTP 超過造模前50%、尿糖超過+++、尿量超過造模前50%，認為DN模型建立成功[6]。DN造模成功大鼠共有60只，按隨機數(shù)字表法分為4組，每組15只，即模型組和TWP治療組(低、中、高劑量)，TWP治療組每日給予TWP混懸液灌胃，劑量分別為4.5、9、18 mg/kg，模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1 次/d，連續(xù)8周給藥。另外15只健康SD大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，且每天給予等體積生理鹽水灌胃，共8周。整個實驗期間，動物進食飲水自由，且降糖藥物及胰島素禁用。

1.4 采集標本及檢測血清生化指標

藥物干預(yù)8周后處死大鼠前，收集24 h尿標本以測定24 h尿蛋白(24 h Upro)；采集大鼠眶下靜脈血，離心速度3 000 r/min，離心半徑15 cm，離心時間15 min，然后取上層血清，采用全自動生化分析儀測定血生化指標，包括血糖(BG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明書上的操作檢測24 h Upro。

1.5 測定腎臟組織中RAGE和NF-κB的表達水平

大鼠腎臟于處死后迅速取出，凍存于-70 ℃，取部分組織勻漿并進行總蛋白含量測定，提取的總蛋白行Western Blot以檢測RAGE和NF-κB的表達水平，一抗4 ℃過夜孵育，所用的一抗為兔抗RAGE多克隆抗體和兔抗NF-κB多克隆抗體，次日孵育二抗1 h，所用二抗為山羊抗兔，采用Gene Tools 圖像分析系統(tǒng)對條帶灰度值進行測定，蛋白表達量為目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)的灰度值之比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組實驗大鼠血糖生化指標及24 h Upro含量比較

與正常組比較，模型組和TWP治療組BG、Scr、BUN及24 h Upro水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TWP治療組上述指標均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且TWP治療組上述指標呈劑量依賴性降低，TWP低、中、高劑量組上述指標組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組實驗大鼠血糖生化指標及24 h Upro含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與TWP低劑量組比較，&P<0.05

2.2 各組大鼠腎組織RAGE、NF-κB表達水平的比較

與正常組比較，模型組和TWP治療組RAGE、NF-κB蛋白表達水平均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，TWP治療組RAGE和NF-κB蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且以TWP高劑量組上述指標降低更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2和圖1)。

組別RAGENF-κB正常組100.00±0.21100.00±0.22模型組211.85±15.16*218.56±16.12*TWP低劑量組188.42±13.13*#176.55±15.00*#TWP中劑量組170.79±13.90*#166.29±14.42*#TWP高劑量組154.80±12.65*#&140.12±13.78*#&F176.35163.89P<0.001<0.001

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與TWP低劑量組比較，&P<0.05

圖1 各組大鼠腎組織RAGE和NF-κB蛋白的凝膠條帶

注：A：正常組；B：模型組；C：TWP低劑量組；D：TWP中劑量組；E：TWP高劑量組

3 討論

DN是DM最常見且嚴重的并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要發(fā)病原因。近年來，DN的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，在我國慢性腎臟病病因中占第2位。目前，在DN的發(fā)病機制中有許多因素涉及，如炎癥反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、缺血缺氧及遺傳等，尚未完全闡明DN的具體發(fā)病機制。DN患者糖代謝紊亂，血糖升高明顯，相關(guān)研究[7]證實，高血糖長期刺激的情況下，腎小管間質(zhì)發(fā)生炎癥纖維化，腎小管出現(xiàn)硬化，對DN的發(fā)生發(fā)展起到明顯促進作用。

TWP是雷公藤的主要有效活性成分之一，可發(fā)揮抗炎、免疫抑制作用，對原發(fā)性腎小球腎炎及免疫相關(guān)性腎炎的療效確切[8]。TWP不僅能拮抗炎癥反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展過程中的不良反應(yīng)，還能使DN患者的尿蛋白排泄降低，進而保護腎小管、抑制腎間質(zhì)纖維化，達到改善腎功能目的。相關(guān)動物實驗[9]也證實了這一點，發(fā)現(xiàn)TWP能減少DN大鼠尿蛋白排泄量、減輕腎臟纖維化程度，進而延緩腎功能進展。本研究發(fā)現(xiàn)，對DN模型大鼠給予不同劑量TWP治療后，BG、Scr、BUN及24 h Upro水平較DN模型組大鼠均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性降低。這表明TWP能改善DN大鼠的糖代謝紊亂及腎損害，進而改善腎功能，與蘆琨等[10]報道一致。

長期高血糖可導(dǎo)致晚期AGEs增多，增多的AGEs結(jié)合特異性受體RAGE可使多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，如細胞內(nèi)蛋白激酶 C、NF-κB、蛋白酪氨酸激酶、氧自由基等，釋放產(chǎn)生多種炎癥因子及細胞因子，引起各種病理變化，氧化應(yīng)激誘發(fā)和炎癥反應(yīng)擴大會對內(nèi)皮細胞功能造成損傷，且細胞基質(zhì)增生異常，血流動力學(xué)也明顯改變[11]。RAGE是一種免疫蛋白超家族成員，組織中表達量較低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，TWP治療后，DN大鼠腎組織中RAGE表達量開始降低，且以TWP高劑量組降低效果更為明顯(P<0.05)，提示TWP可能通過降低RAGE表達而發(fā)揮DN腎保護作用。RAGE受體的激活能引發(fā)下游級聯(lián)反應(yīng)，尤其是NF-κB信號通路的激活。NF-κB是一種關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，涉及炎癥信號通路，靜息狀態(tài)下，NF-κB存在于胞質(zhì)中，且無活性，這與結(jié)合其抑制蛋白IκB有關(guān)[13]；在高血糖刺激下，NF-κB與IκB分離被激活，NF-κB進入細胞核內(nèi)，與多種細胞因子、趨化因子及細胞間黏附因子等一起參與免疫反應(yīng)過程，繼而導(dǎo)致一系列腎臟病理變化，包括血管內(nèi)皮細胞損傷、血流動力學(xué)異常和細胞基質(zhì)異常增生等[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，TWP治療后DN大鼠NF-κB表達受到抑制，以最高劑量組抑制效果最佳(P<0.05)，提示TWP可抑制DN大鼠腎臟組織中NF-κB的過表達，通過抑制細胞中炎癥通路的激活而保護腎功能?？祩サ萚15]的研究得出與上述類似結(jié)論，發(fā)現(xiàn)地黃多糖可降低STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎組織RAGE和NF-κB蛋白的表達水平，從而對DN大鼠腎損傷有所改善。

綜上所述，TWP對DN大鼠起到一定程度的腎保護作用，機制可能與抑制RAGE/NF-κB信號通路有關(guān)。

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