楊 敏，李 奕，吳東明，劉 騰，劉明全，許 穎△

1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院(成都 610500)

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一，其生存率較低[1-2]，且絕大多數(shù)肺癌為惡性上皮性腫瘤。根據(jù)癌細胞在顯微鏡下組織學上的大小和外觀，肺癌主要分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC約占肺癌病例總數(shù)的85%。腫瘤細胞具有擴散、轉移、復發(fā)和耐藥等特性，轉移性肺癌細胞還具有抗輻射和化療的特點均導致NSCLC患者預后較差[3]。因此，發(fā)掘新的治療方法對于NSCLC的治療顯得尤為重要。

α1-抗胰蛋白酶(A1AT)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，是由內(nèi)胚層上皮細胞產(chǎn)生和分泌的一種糖蛋白。A1AT在肝臟疾病、血管炎、肺氣腫及其他肺部疾病中起著重要的作用[4-9]。當機體發(fā)生惡性腫瘤時，血清中A1AT明顯增高[10]，其主要原因是由于惡性腫瘤具有很強的糖蛋白合成功能，能合成大量的A1AT；同時被腫瘤破壞的正常組織也將其內(nèi)部的A1AT釋放入血。近來有研究[11]表明，突變型P53能夠上調A1AT的表達，導致肺癌的發(fā)生發(fā)展,且與肺癌的不良預后有關。另有研究[12]表明，醌氧化還原酶(NQO1)可以結合A1AT mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)和編碼區(qū)(CR),增強A1AT mRNA的翻譯，導致腫瘤患者的血清A1AT質量濃度升高。此外，F(xiàn)renzel 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，A1AT能夠促進血管生成素樣蛋白4的表達，增強腫瘤的血管生成能力。由此可見，體內(nèi)增高的A1AT會影響腫瘤患者的預后。

上皮間質轉化(EMT)是腫瘤發(fā)生轉移的主要過程之一。在正常組織中，EMT與正常器官的發(fā)育與形成、組織的重塑和傷口的愈合有關[14]。EMT在腫瘤中的作用是基于間質標志物的富集(如N-cadherin、Vimentin)和上皮細胞標志物的減少(如E-cadherin)[15-16]。本研究通過檢測EMT相關指標以探討A1AT在NSCLC轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細胞為本課題組保存。A1AT(Cat.No.16382,Proteintech)和β-actin抗體(Cat.No.60008, Proteintech)用于免疫印跡法；E-cadherin(Cat.No.32A8, Cell Signaling)，N-cadherin(Cat.No.22018, Proteintech)，Vimentin(Cat.No.10366, Proteintech)用于免疫印跡法和免疫熒光技術。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Cat.No.511103)和山羊抗兔IgG(Cat.No.511203)購自成都Zen BioScience公司。Cy3標記的山羊抗小鼠IgG(Cat.No.SA00009-1)、山羊抗兔IgG(Cat.No.SA00009-2)和人重組A1AT蛋白(Cat.No.Ag9516)購自美國Proteintech公司。本實驗所用細胞培養(yǎng)皿、6孔板、24孔板、8 μM transwell小室均購自美國Corning公司。ECL顯影液和PVDF膜購于美國Mlllipore公司，化學發(fā)光成像儀購于美國BIO-RAD公司。熒光顯微鏡DM4000B 購于德國萊卡公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶購于美國hyclone公司，胎牛血清購于美國cell max公司，青-鏈霉素購于美國Gbico公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞用含有100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞密度達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，取對數(shù)期生長細胞進行試驗。

1.2.2 免疫熒光技術 將1 cm直徑的無菌蓋玻片置于24 孔板中，接種A549細胞5 ×104個。分別加入終質量濃度為0、600、1 200、2 400 ng/mL 的A1AT，培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)基，用預冷PBS 洗3次，4%多聚甲醛室溫固定細胞。PBS 洗 3 min × 3 次。0.5%的 triton X-100 通透，PBS洗3 min ×3次。用5%山羊血清室溫封閉30 min，分別加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin(1∶200)孵育，4 ℃過夜。PBS洗3 min × 3 次，cy3標記的熒光二抗(1∶500 )，37 ℃避光孵育2 h。PBS洗3 min ×3 次，加DAPI染核5 min，PBS洗 3 min ×3 次，用50%甘油封閉。熒光正置顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復3 次。

1.2.3 免疫印跡法 不同質量濃度的A1AT處理A549細胞24 h后，用RIPA裂解細胞，BCA試劑盒(購自上海碧云天)檢測蛋白質量濃度(要求R2>0.99)，取50 μg蛋白，加入5 × loading buffer處理，煮沸10 min，用12%的SDS page膠跑電泳(濃縮膠80 V，分離膠100 V)，0.22 μM的PVDF膜100轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜。TBST洗3 min × 3 次，HRP標記二抗(1∶10 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗3 min × 3 次，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照，實驗重復3 次。

1.2.4 transwell實驗 準確計數(shù)2 × 104個細胞，加入含有200 μL無胎牛血清培養(yǎng)基的transwell小室(8 μM)，24孔板孔中加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL(transwell小室和24孔板孔中的培養(yǎng)基中都含有相同質量濃度的A1AT)，將transwell小室置于24孔板孔中，培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS洗3次，用甲醇配置的1%結晶紫染色20 min，PBS洗3次，用棉簽輕輕擦去上層細胞，取下底膜，用中性樹膠封閉，顯微鏡下計數(shù)9個視野，取平均值，檢測細胞的轉移能力。對細胞侵襲能力的檢測:matrigel 4 ℃解凍，按無血清培養(yǎng)基∶matrigel=7∶1比例混勻作為膠層，每小室加入50 μL，37 ℃放置1 h待膠凝固，按轉移能力的步驟進行后續(xù)實驗。

1.2.5 劃痕試驗 向6孔板中加入10 × 104個細胞，培養(yǎng)24 h，用槍頭垂直6孔板劃橫線，PBS洗3次，加入含有不同濃度A1AT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按0、24 h的順序拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 外源性A1AT促進A549細胞的轉移和侵襲

為了證實加入A1AT后細胞是否發(fā)生了轉移和侵襲的現(xiàn)象，本研究進行了transwell實驗和劃痕試驗。在加入不同質量濃度的A1AT后，細胞的轉移能力隨著A1AT質量濃度的增高明顯增強(圖1A，圖1B)，侵襲能力也隨著A1AT質量濃度的增高明顯增強(圖1C,圖1D)。細胞劃痕試驗同樣證實了以上結果(圖1E,圖1F)。

圖1 外源性A1AT促進A549細胞的轉移和侵襲

注：A-B：transwell分析檢測不同A1AT(ng/mL)質量濃度下細胞的轉移能力(P<0.01)；C-D：matrigel transwell分析檢測不同A1AT(ng/mL)質量濃度下細胞的侵襲能力(P<0.01)；E-F：劃痕試驗檢測不同A1AT(ng/mL)質量濃度下細胞的轉移能力(P<0.01)

2.2 外源性A1AT對上皮間質轉化標志物的影響

用不同質量濃度的A1AT處理細胞24 h后，通過免疫印跡法檢測EMT標志物的變化情況，結果顯示：隨著A1AT質量濃度的增高,上皮標志物E-cadherin表達量明顯降低，間質標志物N-cadherin和Vimentin表達量明顯升高(圖2A)。細胞免疫熒光實驗(圖2B)同樣證實了這一結果。

圖2外源性A1AT對上皮間質轉化標志物的影響

注：A：免疫印跡法檢測外源性A1AT(ng/mL)處理后，EMT標志物的表達情況；B：免疫熒光技術檢測外源性A1AT(ng/mL)處理后，EMT標志物的表達情況

3 討論

肺癌是人類癌癥相關死亡的主要原因之一，每年有數(shù)以百萬計的新增病例[17]。目前治療方式雖然在外科手術治療、化療和放療方面取得了新進展，但腫瘤轉移仍然是預后不良的主要原因。因此，尋找新的腫瘤轉移相關基因并研究其促進新癌發(fā)生的機制非常重要。A1AT是人類血清中最豐富的蛋白酶抑制因子，在惡性腫瘤發(fā)生時明顯增高。血漿中的A1AT主要由肝臟產(chǎn)生，單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞和部分腫瘤細胞也可合成，這些肝外合成的A1AT在局部組織損傷的調節(jié)中起著重要作用[18-19]。很多研究[20-21]表明A1AT在各種癌癥，如肺癌、前列腺癌和乳腺癌中水平會增加，但是在一些良性肺病(如COPD、肺部炎癥等)水平也會升高。Pérez-Holanda等[22]研究(267例結直腸癌患者+327例健康對照組)也表明，結腸癌患者組的A1AT水平顯著高于對照組。綜上所述，A1AT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

研究[23-25]表明，EMT在腫瘤的轉移與侵襲中發(fā)揮了重要作用。腫瘤細胞是否轉移直接影響肺癌患者的生存率，而EMT是癌細胞轉移起始過程關鍵步驟之一，因此我們通過檢測EMT標志物來探討A1AT對肺癌細胞的影響。EMT與間質標志物的增加(如N-cadherin、Vimentin)和上皮標志物(如E-cadherin)的減少有關[26-29]。本研究免疫印跡法結果顯示，隨著A1AT質量濃度的增高，E-cadherin的表達量明顯降低，N-cadherin、Vimentin含量明顯增高，表明隨著A1AT質量濃度的增加，細胞發(fā)生了明顯的EMT。免疫熒光技術同樣證實了這一結論。腫瘤的轉移途徑包括細胞粘附分子的損失、轉移和侵襲能力的增強、進入血管、溢出、定值[30]。本研究的transwell實驗和劃痕試驗顯示，隨著A1AT質量濃度的增高，細胞的轉移和侵襲能力明顯增強，表明A1AT能夠增強細胞的轉移和侵襲能力。

綜上所述，外源性A1AT能夠增強NSCLC的轉移與侵襲。因此，靶向阻斷NSCLC患者A1AT合成與分泌具有潛在的治療作用。

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